БИОХИМИЯ

УДК 577.153.+616.36+455.625

О. К. Бдоян, Л. Л. Данилова, Г. В. Элбакян, академик К. Г. Карагезян

Характеристика структурно-метаболических нарушений
мембраносвязанных фосфолипидов при оксидативном стрессе,
индуцированном адреналиновой гипергликемией

(Представлено 4/IХ 2006)

   Ключевые слова: фосфолипиды, свободнорадикальное окисление, мембраны, эритроцитов, гипергликемия

   Исследованиями последних лет [1-9] пo экспериментальному сахарному диабету (СД), моделированному аллоксаном, выявлен ряд принципиально новых особенностей в расстройствах реакций тканевого метаболизма фосфолипидов (ФЛ), ФЛ-ФЛ соотношений и интенсивности течения процессов свободнорадикального окисления (СРО) липидов, имеющих существенное значение в регуляции филогенетически запрограммированного статуса клеточной активности [10,11].
   Целью настоящей работы является изучение особенностей нарушений метаболизма ФЛ в мембранах эритроцитов (МЭ) белых крыс как наиболее приближенного прототипа мембранных образований тканей различных уровней дифференциации в отдельные периоды развития гипергликемии, индуцированной адреналином.
   Исследования проводили на 126 белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, содержавшихся в ординарных условиях вивариях и голодавших перед началом экспериментов в течение 12 ч. Внутривенное введение адреналина в количестве 2.5 мкг/100 г массы тела производили проколом кожи шприцeм по биссектрисе угла венозного расширения, образованного верхней полой и подключичной венами при крестообразной фиксации белых крыс на станках для мелких животных. Забор крови в объеме 2 мл производили из указанной области через 15, 30, 45 и 60 мин после внутривенной инъекции адреналина.
   МЭ выделяли по методу, описанному Лимбер [12]. К 4.5 мл крови прибавляли 0.5 мл 1.5%-ногo раствора оксалата натрия, тщательно перемешивали, центрифугировали 15 мин при 1000 g на рефрижераторной центрифуге К-23. Плазму сливали, осадок - эритроцитарную массу дважды промывали изотоническим раствором NaCl с последующим центрифугированием. Отмытую эритроцитарную массу суспендировали в буферном растворе (0.01 М NaHCO3, 0.003 M NaCl) c ЭДТА в соотношении 1:5, смесь центрифугировали при 12000 g на рефрижераторной центрифуге К-24 в течение 40 мин. Надосадочную жидкость сливали и осадок дважды промывали буфером без ЭДТА, центрифугировали при 12000 g в течение 30 мин. Процедуру повторяли два раза, последний раз с использованием буфера трис-HCl, pH 7.2.
   МЭ переносили в фарфоровую ступку, добавляли 15-20 мл ацетона, содержимое тщательно растирали с помощью пестика и сушили под током холодного воздуха до образования сухого остатка [13]. Экстракцию ФЛ и их количественное определение производили по Фолчу [14]. Фракционирование индивидуальных ФЛ проводили методом одномерной восходящей тонкослойной хроматографии с использованием системы растворителей хлороформ-метанол-аммиак (65:35:5). Экстракты ацетоновых порошков наносили на пластины в трех точках, удаленных от нижнего края пластины на 2 см. Пластины высушивали на воздухе и окрашивали в парах йода. Пятна ФЛ идентифицировали с помощью соответствующих стандартных свидетелей (Sigma). После элюирования подкисленным метанолом элюаты выпаривали досуха и сжигали в среде серной и азотной кислот для минерализации органического фосфора, количественное определение которого основано на измерении оптической плотности синего окрашивания, развивающегося в результате инкубирования его в присутствии молибденовокислого аммония и витамина С при 37oС в течение 1.5 ч. После охлаждения пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 830 нм [15].
   Как вытекает из данных, отраженных в табл. 1, по истечении 60 мин после инъекции адреналина развитие гипергликемической реакции организма характеризуется ярко выраженными качественно-количественными нарушениями ФЛ всех категорий. Наиболее демонстративными при этом представляются уменьшение содержания фосфатидилхoлинов (ФХ) и параллельно развивающееся возрастание уровня лизофосфатидилхолинов (ЛФХ), указывающие на интенсивность протекания реакций деацилирования ФХ, катализируемых воздействием чрезмерно активировавшейся фосфолипазы A2 (ФЛазы A2).

Таблица 1

Динамика количественных изменений фосфолипидов (в мкг липидного фосфора
/мл мембран эритроцитов) в мембранах эритроцитов белых крыс через 15 (1), 30 (2),
45 (3) и 60 (4) мин после введения адреналина

Фракции Kонтроль Aдреналин
фосфолипидов 1 2 3 4
Лизофосфати- 3.0±0.4 3.9±0.1x 4.1±0.2x 4.3±0.1x 16.9±0.1x
дилхолины
Монофосфои- 5.0±0.4 6.5±0.7x 7.9±0.5x 8.5±0.6x 9.7±0.8x
нозитиды
Сфингомиелины 26.7±1.1 23.7±0.9xx 20.6±1.1x 18.9±1.2x 16.9±1.0x
Фосфатидилхолины 39.3±1.21 33.2±1.0xx 30.0±1.1xx 26.2±1.1x 24.7±1.2x
Фосфатидилсерины 11.9±0.6 10.1±0.4xx 8.8±0.5x 7.9±0.5x 7.0±0.5x
Фосфатидилэта- 7.9±0.4 8.5±0.6xxx 9.3±0.4x 10.6±0.6x 10.8±0.5x
ноламины
СФЛ 95.0±1.6 85.9±1.5xxx 80.7±1.2x 75.9±1.4x 86.0±1.0x
СНФЛ 77.2±1.3 69.3±1.3xxx 64.0±1.4xx 59.5±1.4x 69.5±1.3x
СКФЛ 17.8±0.6 16.6±0.6x 16.7±0.5x 16.7±0.5x 16.7±0.6x
К СНФЛ/СКФЛ 4.3±0.06 4.3±0.06x 3.8±0.05x 3.6±0.05x 4.1±0.04x
       Примечания: n=28; x-P < 0.001; xx-P < 0.01.

   Mаксимальным антиоксидантным действиeм облaдaeт тиосульфат натрия (ТСН), молекулярный механизм детоксицирующего действия которого обусловлен инактивированием ФЛазы A2, обладающей, как известно, мощным катализирующим действием на процесс деацелирования ФХ в различных биологических образованиях, в частности в МЭ. Образующиеся в результате большие количества ЛФХ (или лизолецитинов) выступают в роли стимуляторов массового гемолиза с формированием необратимого гипоксического синдрома с летальным исходом. Обладая ярко выраженным антигемолитическим действием, ТСН проявляет также мощную антирадиационную активность путем превентирования процесса окисления структурных белков, их сульфгидрильных групп, комплексообразование которых с ДНК сопровождается формированием систем, не поддающихся разрушительному действию радиационного фактора.
   Приведенные примеры антирадикального, антитоксического и стимулирующего действия ТСН на репарационные процессы при различных отклонениях нормального функционирования многочисленных биологических систем организма на клеточном, субклеточном, мембранном и молекулярном уровнях ставят ТСН в ряд наиболее эффективных терапевтических средств.
   ТСН не вызывал сколько-нибудь заметных отклонений в динамике количественных изменений изученных фракций ФЛ в МЭ, что явилось свидетельством его стабилизирующего действия на регуляторные механизмы, нормализующие качественно-количественный уровень исследованных соединений, характерный для нормально метаболизирующих эритроцитов крови (табл.2).

Таблица 2

Динамика количественных изменений фосфолипидов (в мкг липидного фосфора
/мл мембран эритроцитов) в мембранах эритроцитов белых крыс через 15 (1), 30 (2),
45 (3) и 60 (4) мин после однократной внутривенной инъекции 1 мл сверхнизких
концентраций (10-4М, 10-8М, 10-12М - усредненные данные) тиосульфата натрия
спустя 2 ч после его введения

Фракции Контроль 1 2 3 4
фосфолипидов
Лизофосфати- 3.5±0.4 3.7±0.4 3.7±0.4 3.2±0.4 3.6±0.4
дилхолины
Монофосфоино- 4.9±0.3 5.1±0.5 5.1±0.3 5.3±0.4 5.3±0.4
зитиды
Свингомиелины 26.9±0.4 27.1±0.5 27.2±0.4 27.3±0.5 27.5±0.5
Фосфатидилхолины 38.7±1.2 38.6±0.6 38.9±0.7 40.3±0.8 41.0±0.8
Фосфатидилсерины 12.5±0.6 12.7±0.7 12.7±0.6 12.9±0.6 12.8±0.7
Фосфатидилэ- 7.1±0.4 7.3±0.4 7.3±0.4 7.4±0.4 7.5±0.4
таноламины
СФЛ 96.3±1.8 94.4±1.8 94.8±1.2 97.1±2.0 97.7±2.0
СНФЛ 76.2±1.3 76.7±1.3 77.0±1.3 78.9±1.4 79.6±1.4
СКФЛ 17.4±0.7 17.4±0.3 17.8±0.7 18.2±0.7 18.1±0.7
К СНФЛ/СКФЛ 4.3±0.1 4.3±0.11x 4.3±0.11x 4.3±0.19x 4.40±0.11x
       Примечания: n=35; обозначения те же, что и в табл. 1, без обозначений расхождения от контроля
статистически не достоверны.

   Таким образом, изолированное введение ТСН не сопровождается статистически достоверными изменениями характеристик изученных показателей, что служит доказательством его общестабилизирующего действия.
   Изучение особенностей 2-часового действия использованных разновидностей сверхнизких доз ТСН на фоне стабилизированной 60-минутной гипергликемии, моделированной адреналином, позволило прийти к заключению о неоднотипности проявления антиокислительной активности этого соединения применительно к отдельным представителям ФЛ в МЭ. Отмечающаяся в целом отчетливо проявляющаяся тенденция к упорядочению количественного содержания всех фракций ФЛ в отдельности и в изученных суммарных выражениях не характеризовалась, тем не менее, их полнейшей нормализацией (табл. 3). Отмеченный разнобой, выразившийся в разнонаправленности количественных сдвигов нейтральных и кислых ФЛ (НФЛ и КФЛ соответственно), не отразившийся в конечном счете на сумме ФЛ (СФЛ), расценивается как одно из частных проявлений среди многочисленных компенсаторно-приспособительных реакций организма, которое имеет, несомненно, важное значение в поддержании и стимулировании физиологического стереотипа деятельности данной биологической системы. Вместе с тем нельзя обойти вниманием факт продолжающейся убыли содержания ФХ и отмечающегося на этом фоне одновременного, более чем 5-кратного количественного доминирования ЛФХ над величиной одноименного показателя в контроле. Hесмотря на отсутствие статистически достоверных расхождений в величинах СФЛ, СНФЛ, СКФЛ незначительные их отклонения от контрольных уровней оставляют, тем не менее, свой след на величине коэффициента (К) СНФЛ/СКФЛ.
   Oсобенности количественных сдвигов ФЛ всех категорий при предварительной сенсибилизации организма введением 1 мл ТСН в концентрации 10-12М и выработанной на этом фоне 60-минутной гипергликемии, моделированной адреналином, приведены в табл. 4.

Таблица 3

Особенности 2-часового действия сверхнизких доз тиосульфата натрия при
нарушениях количественного содержания представителей нейтральных (НФЛ) и
кислых (КФЛ) фосфолипидов, их суммы (СНФЛ и СКФЛ соответственно), а также
коэффициента СНФЛ/СКФЛ (в %) в мембранах эритроцитов крови белых крыс с
моделированной адреналином 60-минутной гипергликемией

Фракции Тиосульфат натрия (1.0 мл)
фосфолипидов Kонтроль Aдреналин 10-4М 10-8М 10-12М
Лизофосфати- 3.0±0.4 16.9±1.0x 16.6±0.9x 16.4±0.9x 16.7±1.0x
дилхолины
Монофосфои- 5.0±0.4 9.7±0.8x 8.8±0.7x 6.8±0.8xx 5.6±0.5
нозитиды
Сфингомиелины 26.7±1.1 16.9±1.0x 19.9±1.1xx 23.4±1.0x 26.4±1.1
Фосфатидилхолины 39.3±1.2 24.7±1.2x 25.8±1.0x 26.1±1.1x 27.5±1.0x
Фосфатидилсерины 11.9±0.6 7.0±0.5x 8.1±0.5xx 9.7±0.6xx 11.2±0.5
Фосфатидилэта- 7.9±0.4 10.8±0.5x 9.9±0.5xx 8.8±0.4xx 8.1±0.5
ноламины
СФЛ 95.0±1.2 86.0±1.0x 88.4±1.0xx 91.3±1.0 95.2±1.0
СНФЛ 77.2±1.0 69.3±1.3x 71.5±1.0xx 74.7±0.9xx 78.4±0.9x
СКФЛ 17.8±0.6 16.7±0.6x 16.9±0.6x 16.6±0.5x 16.8±0.6
К СНФЛ/СКФЛ 4.3±0.1 4.1±0.04x 4.2±0.04x 4.5±0.05x 4.7±0.05x
       Примечания: n=28, x-P < 0.001, xx-P < 0.01; без обозначений расхождения статистически не достоверны

   ТСН, заранее введенный в организм в отмеченной выше сверхнизкой концентрации, выступает в роли мощного синергиста a-токоферола, являющегося основным составляющим в системе эндогенной антирадикальной защиты клетки и принимающeго важное участие в антистрессорной реакции организма.

Таблица 4

Динамика количественных изменений фосфолипидов (в мкг липидного
фосфора /мл мембран эритроцитов) в мембранах эритроцитов крови белых крыс в
контроле, после однократной внутривенной инъекции 1 мл 10-12М тиосульфата
натрия (1) и через 15 (2), 30 (3), 45 (4) и 60 (5) мин после введения 2.5 мкг/100 г
массы тела адреналина на этом фоне

Фракции Контроль 1 2 3 4 5
фосфолипидов
Лизофосфати- 3.9±0.34 3.6±0.3 3.7±0.4 3.7±0.4 3.8±0.5 3.7±0.3
дилхолины
Монофосфоино- 4.5±0.3 4.2±0.4 4.6±0.3 4.4±0.3 4.7±0.3 4.7±0.4
зитиды
Свингомиелины 27.0±0.5 26.9±0.4 27.5±0.5 28.0±0.5 28.1±0.5 27.9±0.4
Фосфатидил- 39.0±0.8 39.7±0.7 40.1±0.8 39.9±0.7 40.1±0.8 39.6±0.7
холины
Фосфатидил- 13.1±0.5 12.7±0.4 12.9±0.5 13.2±0.5 13.1±0.5 12.6±0.4
серины
Фосфатидилэ- 8.1±0.4 7.4±0.5 7.3±0.4 7.3±0.4 7.5±0.5 7.1±0.4
таноламины
СФЛ 95.6±1.8 94.5±1.8 96.1±1.8 96.8±1.8 97.3±1.9 95.6±1.9
СНФЛ 78.0±1.2 77.6±1.3 78.7±1.2 79.0±1.3 79.5±2.0 78.3±1.2
СКФЛ 17.6±0.6 16.9±0.6 16.9±0.6 17.6±0.6 17.8±0.6 17.3±0.7
К СНФЛ/СКФЛ 4.4±0.09 4.6±0.1x 4.5±0.11x 4.48±0.1x 4.40±0.11x 4.5±0.09x
       Примечания: n=35; обозначения те же, что и в табл. 2.

   Примечательно при этом имеющее место полное нивелирование эффектов адреналина на метаболизм ФЛ уже с самого начала формирования гипергликемической реакции организма. Последнее является свидетельством соответствующего ответа организма на предварительное введение ТСН, выразившегося в формировании прочной ответной реакции организма как противодействия, направленного на нейтрализацию токсических воздействий на физиологически протекающие реакции липидного обмена. В случае же использования ТСН на фоне уже индуцированной адреналином гипергликемии характер развития эффектов нивелирования расстроенных сторон метаболизма ФЛ оказывался однотипным, но несколько затянувшимся. Однако и в данном случае, как и в предыдущем варианте эксперимента превалирование умеренно превышающих норму концентраций ЛФХ носит закономерный характер.

   Институт молекулярной биологии НАН РА

Литература

    1. Аганянц М. А., Карагезян К. Г., Овсепян Л. М. - Информационные технологии и yправление. Ереван. 2003. Т. 2. N1. С. 219-227.
    2. Аганянц М. А., Мартиросян Э. А., Овсепян Л. М., Думанян Д. Г., Карабашян Л. В., Карагезян К. Г., Секоян Э. С. B cб.: Современные аспекты реабилитации в медицине. Материалы I Международной конференции. Ереван. 2003. С. 9.
    3. Карагезян К. Г., Едоян А. Р., Овсепян Л. М., Едоян Л. В., Аганянц М. А., Карян Ш. С., Мартиросян Э. А. - Международная Академия наук экологии и безопасности жизнедеятельности. Вестник. Санкт-Петербург. 2003. Т. 8б. N 4. С. 194-196.
    4. Карагезян К. Г., Едоян А. Р., Едоян Л. В., Овсепян Л. М. - Доклады НАН РА. 2003. Т. 103. N 3. С. 251-256.
    5. Карагезян К. Г., Едоян А. Р., Карян Ш. С., Едоян Л. В. - Доклады НАН РА. 2003. Т. 103. N 4. С. 336-341.
    6. Ghazaryan A. V., Hovsepyan L. M., Karageuzyan K. G. - Iranian Journal of Biochemistry and Molecular biology. 2005. P 31.
    7. Мартиросян А. А., Казарян А. В., Секоян Э. С., Карабашян Л. В., Джанполадян Е. Г., Амирханян О. М., Овакимян С. С., Овсепян Л. М., Данилова Л. Л. - Аллергология и иммунология. Афины. 2005. Т. 6. N 3. С. 368.
    8. Karageuzyan K. G., Ktsoyan Zh. A., Ghazaryan A. V., Elbakyan G. V., Sarkisyan N. N., Khachatryan Z. A., Arakelova K. A., Manukyan G. P., Kazaryan K. A., Sedrakyan A. M., Hovhanessyan A. I., Tatyan M. V. - International J. on Immunoreabilitation. Athens. 2005. V. 7. N2. P. 102.
    9. Казарян А. В. - Материалы Международной конференции "Ломоносов 2005". М. 2005. С. 437-439.
    10. Крепс Е. М. Фосфолипиды клеточных мембран нервной системы в развитии животного мира. XXII Баховские чтения Л. Наука. 1967. 74 c.
    11. Крепс Е. М. Липиды клеточных мембран Л. Наука. 1981. 330 c.
    12. Limber G. R., Davie R. F., Haker A. M. S. - Blood. 1970. V. 36. N 2. P. 111-118.
    13. Карагезян К. Г. - Лаб. дело. N 1. 1969. С. 23-26.
    14. Folch J., Lees M., Sloane-Stane G. - J. Biol. Chem. 1957. V. 226. P. 497-509.
    15. Зубер В. Л. В. кн.: Методы биохим. исслед. Л. Изд-во ЛГУ. 1982. С. 74-80.