БИОХИМИЯ

УДК 612.019:591.044

Л. М. Овсепян, академик К. Г. Карагезян, А. В. Мелкумян, Г. В. Захарян

Взаимосвязь окиcлительного фосфорилирования и процесса
перекисного окисления липидов в митохондриальной фракции
головного мозга при гипоксии

(Представлено 2/VI 2006)

   Ключевые слова: окиcлительноe фосфорилированиe,перекисное окисление липидов, гипоксия

   Кислородное голодание организма вызывает метаболические перестройки в тканях, влияя главным образом на систему биологического окисления. Кислород используется клетками в процессе дыхания, в основном митохондриальной системой окисления. Полное восстановление молекулы кислорода до воды требует наличия четырех электронов. При гипоксии понижается концентрация молекулярного кислорода и увеличивается уровень восстановленности компонентов дыхательной цепи, в результате чего стимулируется восстановление кислорода по одноэлектронному пути. В этих условиях в митохондриях (МХ) накапливаются активные формы кислорода; при переносe первого электрона формируется супероксидный радикал, при переносе второго - перекись водорода; наиболее токсичный и реактивный гидроксил - радикал является результатом третьего переноса электрона [1]. При снижении мозгового кровотока и развитии ишемии именно митохондриальная дыхательная цепь переноса электронов становится мощным источником образования активных форм кислорода - нестабильных и крайне реакционноспособных метаболитов.
   Целью настоящего исследования явилось сравнительноe изучениe процессов окислительного фосфорилирования, содержания цитохромов, а также перекисного окисления липидов в митохондриальной фракции головного мозга в норме и при гипоксии.
   Опыты проводили на беспородных белых крысах массой 170-200г. Гипоксию головного мозга вызывали одномоментной окклюзией сонных артерий (30 мин). МХ головного мозга выделяли в среде, содержащей 0.25 М сахарозы и 0.01 М трис-HCl буферa, pH7.4, методом дифференциального центрифугирования при 13000 g, после осаждения ядер при 600 g. Скорость дыхания МХ измеряли полярографически с помощью электрода Кларка в среде инкубации следующего состава, в мМ: сахароза - 100, KH2PO4 - 15, трис HCl - 15 (pH 7.4), ЭДТА - 0.1. В качестве субстратов окисления использовали комплекс субстратов янтарной (4 мМ) и глютаминовой (6 мМ) кислот. Скорость дыхания регистрировали в следующих метаболических состояниях: V2 - состояние покоя до работы в присутствии субстратов окисления; V3 - состояние активной деятельности, стимулированное добавкой в среду АДФ (200 мМ); V4 - состояние отдыха после работы или отрегулированное состояние. Дыхательный контроль, определяeмый отношeнием V3 к V4, отражает степень стимуляции дыхания в зависимости от уровня фосфорилирования [2]. Количество цитохромов paсчитывали по величине поглощения в максимуме поглощения a-полосы при 605 нм для цитохрома а, при 550 нм для цитохрома C, при 562 нм для цитохрома B и при 557 нм для цитохрома B5 [3].
   О содержании диеновых коньюгатов судили по характерному для них поглощению при 233 нм [4], гидроперекисей - по цветной реакции с тиоционатом аммония при максимуме поглощения 480 нм [5], малонового диальдегида - по реакции с тиобарбитуровой кислотой [6]. Количественное определение белка производили по Лоури [7]. Достоверность полученных результатов оценивали методoм вариационной статистики Стьюдента-Фишера.

Таблица 1

Показатели дыхательной и фосфорилирующей активности (в нг ат О/с мг белка)
митохондрий мозга в норме и при гипоксии (субстрат - сукцинат+глютамат) (n = 7)

Показатели V2 V3 V4 ДК Т фосфор.
Kонтроль 2.49±0.16 5.45±0.2 2.59±0.16 2.18±0.15 20±1.2
Гипоксия 2.28±0.17 2.44±0.16* 2.38±0.12 1.07±0.17* 40±1.3*

                           Примечание: *р < 0.001.

   Как видно из табл.1, МХ мозга контрольных крыс при наличии сукцината и глютамата в качестве субстрата окисления поглощают 2.49 нг атомов кислорода на 1 мг белка. Добавление АДФ оказывает приблизительно двукратное стимулирующее воздействие на этот процесс, дыхательный контроль при этом колеблется в пределах 2.18, и по этой величине представляется возможность судить о способности дыхательной цепи к ускорению процесса переноса электронов на фоне введения экзогенной АДФ и переходу в отрегулированное состояние. Согласно результатам проведенных исследований гипоксия сопровождается заметным уменьшением скоростей дыхания V2 и V4, удлинением времени фосфорилирования и резко выраженным уменьшением скоростей V2 и V3, что является отчетливым показателем серьезности нарушений в процессе передачи электронов по дыхательной цепи. Величина дыхательного контроля, равная 1.07, указывает на почти полноe разобщениe процессов дыхания и фосфорилирования при гипоксии. Этот комплекс изменений однозначно свидетельствует о нарушении при гипоксии сопряжения окисления и фосфорилирования в МХ. Снижение скорости переноса электронов в активном и разобщенном состояниях может быть обусловлено изменением активностей комплексов дыхательной цепи МХ или изменением содержания цитохромов. В табл.2 представлены данные об уменьшении содержания цитохромов в дыхательной цепи переноса электронов в МХ мозговой ткани гипоксических животных.

Таблица 2

Cодержание цитохромов в митохондриях головного мозга в норме
и при гипоксии (нмоль/мг белка) (n = 5)

Цитохром Kонтроль Гипоксия
В 0.140±0.006 0.112±0.005**
С 0.182±0.012 0.133±0.011***
С-1 0.159±0.007 0.112±0.006*
а 0.238±0.009 0.205±0.008***
В-5 0.183±0.011 0.128±0.009**

       Примечание: * - р < 0.001; ** - р < 0.01; *** - p < 0.02.

   При исследовании процесса перекисного окисления липидов нами обнаружено увеличение содержания продуктов свободнорадикального окисления - диеновых коньюгатов, гидроперекисей и малонового диальдегида в МХ. Увеличению содержания перекисей в головном мозгe способствуют высокое содержание в нем легко окисляемых субстратов, таких как полиненасыщенные жирные кислоты и катехоламины; сравнительно низкий уровень антиоксидантов - глютатиона и витамина Е и антиоксидантных ферментов (глютатионпероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы); наличие высокого содержания в МХ негеминового железа, которoe является активатором ПОЛ, а также недостаточность кислорода при гипоксии, приводящие к активированию свободнорадикальных реакций.
   Мишенью повреждающего действия свободных радикалов являются белки, нуклеиновые кислоты и липиды клеточных мембран. Механизм ингибирующего действия свободных радикалов кислорода на активность ферментов связывают с окислительной модификацией аминокислотных остатков мембранно-зависимых ферментов. Согласно данным Цханга и соавт. [8] NАДН-оксидаза, NАДН-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, сукцинатоксидаза и F0F1-АТФаза ингибируется гидроперекисями и супероксидрадикалами. Окислительная модификация белков может сопровождаться их агрегацией [9]. Нам представляется, что одним из объяснений сниженной активности окислительного фосфорилирования при гипоксии может быть как ингибирование ферментов, так и нарушение белок-белковых и белок-липидных взаимоотношений в дыхательных комплексах МХ, где помимо отмеченного одной из главных мишеней ОН-радикалов является ДНК [10]. Примечательно, что ДНК МХ, кодирующая небольшое количество пептидов NАДН-дегидрогеназы, апоцитохром в, субъединицы 1-3 цитохромоксидазы и шестую и восьмую субъединицы F0F1-АТФазы, обладают большей, чем ядерная ДНК, чувствительностью к действию оксидантов [11].

Таблица 3

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в головном мозгe в норме и
при гипоксии (n = 7)

Показатель Kонтроль Гипоксия
Диеновые коньюгаты, нмоль/мг белка 1.22±0.15 2.94±0.18*
Гидроперекиси, Е/мг белка 0.62±0.02 1.12±0.03*
МДАнмоль/мг белка 5.2±1.2 11.3±1.4*

      Примечание: * - р < 0.001.

   Таким образом, наблюдаемое нами снижение скорости дыхания МХ в активном и разобщенном состояниях, коэффициента АДФ/О, также уменьшение содержания цитохромов дыхательной цепи являются результатом окислительного повреждения белков и нуклеиновых кислот в МХ свободными радикалами, образующимися в дыхательной цепи при гипоксических состояниях.

   Институт молекулярной биологии НАН РА

Литература

    1. Болдырев А. А. - Нейрохимия. 1995. Т. 12. N3. С. 271-278.
    2. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом Г. М. Франк. 1973. М. Наука. 120c.
    3. Евдотиенко Ю. В., Мохова Е. Н. Механизмы дыхания, фотосинтеза и фиксация азота. 1967. М. Наука. C. 35-48.
    4. Романова Л. А. Стальная И. Д. В кн.: Современные методы в биохимии. 1977. М. Наука. С. 63.
    5. Стальная И. Д. В кн.: Современные методы в биохимии. 1977. М. Наука. С. 64
    6. Владимиров Ю. А. Арчаков А. И. B кн. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. 1972. М. Наука. С. 252.
    7. Lowry O., Rosenbogh N., Farr A. - J. Biol. Chem. 1951. V. 153. N1. P. 265-275.
    8. Zang Y., Marcillat O. - J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 16330-16336.
    9. Halliwell B. - In: Free Radikals in the Brain. 1992. P. 21-40.
    10. Calabrese V., Scapagnini G, Bates T. E. - Neurochemikal Research. 2001. V. 26. N6. P. 739-765.
    11. Mecocci P., Beal M. F., Cecchetti R. et al - Mol. Chem. Neuropathol. 1997. V. 31. P. 53-64.