БИОХИМИЯ

УДК 616.579+599.322

А. Р. Варданян, Г. М. Симонян, академик К. Г. Карагезян, М. А. Симонян

Воздействие фракции c антиоксидантной активностью, полученной
из белкового железа огородной улитки Helix, на эндогенный уровень
металлопротеинов крови крыс при аллоксановом диабете

(Представлено 9/ХII 2005)

   Ключевые слова: белковое железо улитки, антиоксидантная активность, аллоксановый диабет, металлопротеины

   В различных органах огородной улитки Helix, особенно в белковой железе, обнаружены ферменты антиоксидантной активности: СОД, каталаза, глутатион-пероксидаза, глутатион-S-трансфераза, глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа. Причем уровень этих антирадикальных защитных систем с повышением продуцирования активных форм кислорода (АФК) фагоцитирующими гемоцитами заметно повышается при возбуждении улиток внешними факторами [1-3]. Обогaщенная антиоксидантами фракция из улитки Helix может быть более доступным, безвредным и эффективным средством для снижения оксидативного повреждения крови при различных патологических состояниях, включая и аллоксановый диабет, по сравнению с антиоксидантными препаратами, полученными из тканей млекопитающих [4-6].
   Цель работы состоит в исследовании полученной из белкового железа огородной улитки Helix фракции, обогащенной антиоксидантными ферментами, как средства для регулирования эндогенного уровня и активности антиоксидантных и прооксидантных металлопротеинов крови крыс при аллоксановом диабете.
   Фракцию с антиоксидантной активностью (ФАА) из белкового железа улитки Helix получали модифицированием биотехнологического способа для выделения и очистки металлопротеинов (МП) [7]. При этом после гомогенизации белкового железа в калий фосфатном буфере (КФБ), рН 7.4, и центрифугирования супернатант подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 ("Whatman"). В итоге из 25 г белкового железа получали 300 мл ФАА с СОД-активностью 3300 ед/г ткани. Этo активность фермента Cu,Zn-супероксиддисмутазы (СОД), которая подавляется перекисью водорода [8]. Каталазная активность ФАА составляла 25 ед/г. Используемая активность для СОД составляла 215 ед/мл, а для каталазы - 2 ед/мл.
   Аллоксановый диабет у белых крыс массой 180-220 г вызывали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана ("Sigma") в дозе 150 мг/кг массы животного. Животные были подразделены на группы (по 12 крыс в каждой): интактные (К), 15-дневные аллоксандиабетические (опытная группа 1, ОГ-1), аллоксандиабетические с трехкратным введением (по 1 мл) ФАА через каждые 3 дня (ОГ-2), аллоксандиабетические с семикратным введением ФАА (ОГ-3). После 12-дневного прерывания подачи ФАА животным ОГ-2 возобновили подачу ФАА еще 4 раза (ОГ- 4). Гибель животных в ОГ-1 составила 14 -15, в ОГ-2 -7-8, в ОГ-3 и ОГ- 4-0%.
   МП антиоксидантной активности (МАА) и МП прооксидантной активности (МПА) получали из крови животных всех групп одновременно. МАА (Cu,Zn-СОД и каталазу - из растворимой фракции эритроцитов, церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) - из сыворотки крови) и МПА (цитохром b5 - из растворимой фракции эритроцитов, изоформы цитохрома b558 I-IV - из сыворотки крови и эритроцитарных мембран (ЭМ) [9], а также О2--продуцирующий липопротеин [10] сыворотки - супрол) выделяли и очищали биотехнологическим способом путем ионообменной хроматографии белковых фракций сыворотки, растворимой части эритроцитов и ЭМ на целлюлозах ДЕ-52 и КМ-52, сефадексе ДЕАЕ А-50 и гель-фильтрации на сефадексe G-100 [11]. Цитохром (цит) b558III и цит b558IV выделяли и очищали без использования детергента, заметно снижающего стабильность указанных гемопротеинов [12]. Количество МП определяли путем измерения характерной для данного белка плотности максимального оптического поглощения: для цит b5 при 525 нм, для изоформ цит b558 - при 530, супрола - 430, ЦП - 610 и ТФ - 470 нм. Активность СОД и супероксид-продуцирующую активность цит b558III и супрола определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом [13] путем измерения процента ингибирования (для СОД) или увеличения (для супрола и цит b558III) образования формазана в результате восстановления НТС супероксидными радикалами (О2-). За единицу СОД-активности принимали количество фермента, снижающее продуцирование формазана (при 560 нм) на 50%. Удельную СОД-активность определяли в расчете на 1 мл эритроцитов. За единицу НАДРН-зависимой О2--продуцирующей активности цит b558III и супрола [14] принимали количество белков, повышающих образование формазана на 50%. Удельная О2--продуцирующая активность для цит b558III была рассчитана на 1 мл эритроцитов, а для супрола - на 1 мл сыворотки. Для определения О2- - продуцирующей активности цит b558III в гетерогенной фазе (в ЭМ) к реакционной смеси добавляли 0.5 мл ЭМ, смешанных с 0.04 М КФБ. Метгемоглобин (метНb)-восстанавливающую активность цит b558III [14] определяли путем измерения процента снижения плотности поглощения альфа-полосы (при 565 нм) мет Нb (ферриНb-Fe+3) в течение 4-8 ч при 30o. Такое снижение плотности поглощения альфа-полосы прямо пропорционально увеличению уровня образовавшегося ферpoHb (Fe+2 - Hb) при 555 нм. За единицу метHb-восстанавливающей активности цит b558III принимали количество гемопротеина, уменьшающее интенсивность плотности альфа-полосы до 0.05 в течение 30 мин при 30o. Удельная метHb-восстанавливающая активность цит b558III была определена в расчете на 1 мл эритроцитов. При определении метНb-восстанавливающей активности цит b558III в гомогенной фазе величина плотности поглощения изолированного цит b558III (А530) в реакционной смеси (3 мл) составляла 0.02. Расчетный уровень добавленного к реакционной смеси цит b558III в гетерогенной фазе (в 0.5 мл ЭМ) в 5-10 раз ниже по сравнению с содержанием цит b558III в гомогенной фазе. Процедура определения метНb-восстанавливающей активности такова: непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 2.5 мл свежеполученного метНb добавляли 0.5 мл изолированного цит b558III (гомогенная фаза) или 0.5 мл ЭМ, смешанных с 0.04 М КФБ (гетерогенная фаза). После быстрого смешивания реакционной смеси ее оставляли в покое и осторожно (без перемешивания) регистрировали снижение плотности альфа-поглощения метНb при указанных выше условиях. Оптические спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Specord UV-VIS" (Германия) с длиной оптического пути 1 см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности.
   У алоксандиабетических крыс на 15-й день эксперимента наблюдается повышение уровня цит b5 на фоне снижения эндогенного уровня сывороточных (цит b558I, b558II) и ЭМ цитохромов (цит b558II, цит b558IV). Увеличивается НАДРН-зависимая супероксид-продуцирующая и метНb-восстанавливающая активность цит b558III. Возрастает и супероксид-продуцирующая активность супрола. Из МАА существенно снижается уровень каталазы и ЦП (табл.1). Уровень Сu,Zn-СОД и ТФ несколько повышается. Снижение уровня каталазы может привести к повышению уровня перекиси водорода в эритроцитах. Причем перекись водорода необратимо деградирует и цит b558III ЭМ [15].

Таблица 1

Относительные изменения (%) эндогенного уровня и активности МАА и МПА в ОГ
1-4 по сравнению с 100%-ными контрольными показателями (Р < 0.05, n = 8 )

МП, активность ОГ-1* ОГ-2* ОГ-3** ОГ-4***
Цит b5 +37.1 +/- 3.6 -14.3 +/- 2.2 41.2 +/- 4.0 +21.3+/- 2.3
Цит b558 I, II -23.4+/-1.9 -77.0+/-4.3 -43.3=+/-2.8 -10.2+/-0.8
Цит 558 III -36.5+/-3.1 -42.3+/-3.4 -16.3+/- 1.4 +7.3+/-0.5
Цит 558 IV -40.0+/-3.9 -28.7+/-2.4 -15.0+/-1.2 +10.2+/-1.1
О2- продуци- +28.1+/-2.2 +35.2+/-2.9 +18.1+/-3.0 +14.0 +/- 2.1
рующая актив-
ность цит 558III
МетНb восста- +235+/-1.3 +26.1+/-2.1 +29.3+/-4.0 +32.2+/-4.4
навливающая
активность
цит b558III
Супрол +9.5+/-2.0 -15.8+/-1.7 -5.5+/-0.4 +2.3+/-0.2
О2- - продуци- +60.2+/-4.9 -80.0+/-5.1 +171.0+/-21.4 +12.3+/-1.1
рую щаяактив-
ность супрола
ЦП -44.5+/-4.2 -41.3+/-3.5 -33.4+/-2.1 -10.1+/-1.2
ТФ + 4.7+/-0.2 -56.0+/-3.1 -28.6+/-3.5 +8.4+/-1.1
Cu,Zn-СОД +10.0+/-0.3 -12.3+/-1.6 -16.6+/-2.2 +4.5+/-0.8
Каталаза -45.7+/-2.4 -2.9+/-0.3 -19.8+/-2.0 +12.2+/-1.5

Примечание: животные были декапитированы на 15-й (*), 36-й (**) и 60-й день (***) эксперимента

   Фактически этот эффект наблюдается и при аллоксановом диабете в описанном режиме. Расчетный суммарный уровень МАА (антиоксидантный статус - АС) и МПА (прооксидантный статус - ПС) сыворотки крови и эритроцитов изменяется почти адекватно. Исключение составляет ПС сыворотки крови, который существенно повышается (табл.2). Фактически метаболизм АФК в крови существенно различается на 7- и 15-й день аллоксанового диабета [16], при этом дельта-содиндуцирующий пептид оказывает определенное положительное воздействие на процессы регулирования эндогенного уровня МАА и МПА, а также глюкозы в крови животных [17]. В ОГ-2 трехкратное введение ФАА крысам приводит к существенному снижению эндогенного уровня МАА и МПА с адекватным снижением АС и ПС сыворотки и эритроцитов (табл.1, 2). При семикратном введении ФАА (ОГ-3) наблюдается некоторое приближение рассматриваемых показателей к норме.

Таблица 2

Относительные изменения (%) АС и ПС сыворотки крови и эритроцитов в ОГ 1-4,
по сравнению с 100%-ными контрольными показателями (Р < 0.05, n = 8)

Компоненты ОГ-1 ОГ-2 ОГ-3 ОГ-4
крови
АС ПС АС ПС АС ПС АС ПС
Сыворотка -39.8 +79.7 -97.3 -95.8 -62.0 + 165.5 -1.7 14.6+/-
+/- 3.3 +/-4.1 +/-6.1 +/- 7.0 +/- 4.1 +/- 11.3 +/- 0.3 1.8
Эритроциты -35.7 -33.8 -15.2 -127.1 -36.4 -15.5 +57.2 + 42.8
+/-2.4 +/-3.1 +/-1.4 +/-14.5 +/-4.2 +-1.3 +/-4.6 +/-3,1

   Если при семикратном введении ФАА (ОГ-3) уровень глюкозы в крови и фосфолипидного обмена в других органах имеет тенденцию к нормализации [18], то АС и ПС в основном не приближаются к норме. Картина определенно изменяется в ОГ-4, где эндогенные уровни МАА и МПА, а также АС и ПС в основном приближаются к норме. При этом остается еще повышенной метНb-восстанавливающая активность цит b558III, что также обусловлено действием адаптационных механизмов организма для улучшения кислородного гомеостаза [14]. Такой режим подачи ФАА в ОГ-4, видимо, дает организму возможность создания соответствующих адаптационных систем с новым физиологическим статусом, более чувствительным к воздействию уже "привычных" экзогенных антиоксидантных систем, в частности ФАА, имеющей не только супероксиддисмутазную, но и каталазную активность (не исключается и положительный эффект пока не определенных компонентов в полученной фракции из белкового железа огородных улиток). B результате этого существенно ослабляется стрессорное состояние организма, что положительно влияет и на восстановление функции клеток поджелудочной железы.
   Таким образом, использованная в описанном режиме ФАА оказывает положительнoe воздействие на регулирование эндогенных уровней МАА и МПА при аллоксан-индуцированном диабете.

   Институт биохимии им. Г. Х. Бунятяна НАН РА

Литература

    1. Dikkebaum R., van der Knaap W.P., van der Bevenkamp W. et al. - Dev.Comp.Immunol. 1998. V. 12. Р. 509-520.
    2. Romas-Vasconcelos G. R., Hermes-Lima M. - J. Exp. Biol. 2003. V. 206. P. 675-685.
    3. Hermes-Lima M., Storeey K. B. - Am.J.Physiol. 1995. V. 268. P. R1368-R1393.
    4. Grankvist K. - Nature. 1981. V. 294. Р. 158-162.
    5. Gandy S. E. - J. Clin.Invest. 1982. V. 70. Р. 658-659.
    6. Симонян М. А., Геворкян Д. Н., Мхитарян В. Г. - Бюлл. эксп. биол. мед. 1987. Т. 103 С. 306-308.
    7. Симонян М. А. Открытия. Изобрет. (СССР). 1988. 28. C. 107.
    8. Овакимян С. С., Арутюнова Л. Д., Качворян Э. А., Карагезян К. Г. - ДНАН Армении. 2005. Т. 105. С. 288-294.
    9. Симонян М. А., Бабаян М. А., Симонян Г. М. - Биохимия. 1995. Т. 60. С. 1977-1987.
    10. Симонян М. А., Карапетян А. В., Бабаян М. А.,Симонян Р. М. - Биохимия. 1996. Т. 61. С. 932-938.
    11. Симонян М. А., Симонян Г. М. - Лицензия изобрет. № 341 Армпатента. Ереван. 1997.
    12. Симонян М. А., Симонян Г. М., Симонян Р. М. - Лицензия изобрет. № 908 Армпатента. Ереван. 2001.
    13. Nishikimi M., Rao N., Jagi K. - Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V. 62. P. 849-856.
    14. Симонян Р. М., Симонян Г. М., Симонян М. А. - Мед. наука Армени. 2004. Т. 44. N1. С. 43-46.
    15. Симонян Г. М., Григорян Г. Г., Симонян Р. М., Симонян М. А. В кн.: Актуальные вопросы военной медицины. Гос.мед.унт. Ереван. 1999. С. 48-51.
    16. Варданян А. Р., Геворкян Д. Н., Агаджанов М. И., Симонян М. А. - Мед. наука Армении. 1999. Т. 39. N2. С. 38-42.
    17. Варданян А. Р., Геворкян Д. Н., Агаджанов М. И., Симонян М. А. - Мед. наука Армении. 2000. Т. 40. N1. С. 20-22.
    18. Овакимян С. С., Арутюнова Л. Д., Качворян Э. А., Карагезян К. Г. - ДНАH Армении. 2005. Т. 105. N3. С.288-294.