Reports-2005-Vol105-N4-Simonyan

БИОХИМИЯ

УДК 577.612.01

Р. М. Симонян, Г. М. Симонян, М. А. Симонян

Ингибирование цитохромом b558III супероксид-продуцирующей
активности супрола и ее стимулирование
тетрахлором углерода in vitro

(Представлено академиком М. А. Давтянoм 16/III 2005)

   Супероксид-продуцирующий липопротеин - супрол локализован в сыворотке крови млекопитающих [1] и рыб [2] и является липопротеином высокой плотности, продуцирующим супероксидные радикалы в присутствии следов ионов переходных металлов (Fe⁺³, Cu⁺²) in vitro и in vivo [3]. Это имеет место, в частности, при интоксикации крыс ионами переходных металлов [4,5], а также при сердечно-сосудистых заболеваниях [6]. Продуцированные и их производные (1O₂, H₂O₂, HO^·, NO^· и др.) инициируют перекисное окисление фосфолипидных остатков самого супрола, вызывая агрегацию супрола. Это, в свою очередь, может изменить вязкость крови и воздействовать на гемодинамику и тромбообразование [7]. Супрол продуцирует в течение сравнительно долгого времени (5-6 ч) в аэробных условиях in vitro, в отличие от других -продуцирующих систем [7]. При этом продуцированные нормально дисмутируются антиоксидантными препаратами различного характера [7]. Обнаружение биологических средств, ингибирующих продуцирование супролом, может иметь важное значение для стабилизации или предотвращения агрерации супрола. По предварительным результатам супрол продуцирует и в присутствии следов "связанного" железа (например, железа гемовой группы гемоглобина), а цитохром (цит) b558III обладает способностью образовывать нестабильный комплекс с метгемоглобином (метHb) за счет NO^·, присутствующего в гемовой группе цит b558III как 5-й или 6-й лиганд железа [8]. Целью работы явилось определение характера воздействия цит b558III и CCl₄ на супероксид-продуцирующую активность супрола in vitro
   Цит b558III из эритроцитарных мембран (ЭМ) и супрол из сыворотки крови крыс получали биотехнологическим способом [9], без использования детергента [10]. При этом цит b558III получается в электрофоретически гомогенном состоянии, а супрол содержит небольшие следы гемопротеина (Hb). Активирование супрола (для продуцирования ) осуществляли следами ионов Fe⁺³ [3]. -продуцирующую активность супрола и цит b558III определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом [9], рассчитав проценты повышения плотности максимального оптического поглощения формазана (при 560 нм), образовавшегося в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу - продуцирующей активности супрола или цит b558III принимали количество белка, вызывающее 50%-ное увеличение плотности поглощения формазана. Удельная - продуцирующая активность супрола и цит b558III была определена в расчете на 1 мл сыворотки и эритроцитов соответственно.
   Оптические спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре ''Specord UV/VIS'' (Германия) с длиной оптического пути 1 см при 20^o.
   Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с расчетом критерия достоверности P.
   В результате небольшого гемолиза эритроцитов (наблюдающегося при декапитировании крыс) супрол образует нестабильное комплексное соединение с метHb (рис.1,1). После активирования такого супрола ионами Fe⁺³ форма его оптического спектра не изменяется. При этом на спектре видны характерные максимальные поглощения Hb (альфа- и бетта-полосы поглощения).

Рис.1.

После агрегации (самоосаждения) супрола в результате инкубирования при 4^o в течение 40-50 ч в аэробных условиях и центрифугирования его осадoк имеет красноватый цвет, а супернатант бесцветный. Это свидетельствует о том, что Hb действительно входит в комплексное соединение с супролом. После гомогенизации в 0.04 М калий фосфатном буфере (КФБ) осадка агрегированного с Hb супрола смесь проявляет - продуцирующую активность (рис.2). Под влиянием добавленного цит b558III (A₅₃₀= 0.2) наблюдается снижение (60.5±6.4%, n = 6, P < 0.05) - продуцирующей активности супрола с A₄₃₀= 0.02 в реакционной смеси. В результате его инкубирования (в течение 20-30 мин) с цит b558III при 20^o наблюдается отщепление Hb от супрола и присоединение его к цит b558III.

Рис.2.

При этом осадок агрегированного супрола теряет красный цвет, а супернатант (комплекс цит b558III с Hb) представляет из себя раствор красноватого цвета. Спектр этого раствора имеет смешанную форму спектров Hb и цит b558III, что харктерно для комплекса Hb с цит b558III [11] (рис.3).

Рис.3.

НАДРН-зависимая -продуцирующая активность комплекса цит b558III с Нb на 20-30% выше таковой у цит b558III (рис.4, а). Bидимо, в этом состоянии Hb, как ионы переходных металлов, служит переносчиком электрона от НАДРН (группа в молекуле супрола) к молекулярному кислороду, превращая его в [3]. Цит b558III входит в комплексное соединение с отщепленным от супрола Hb, в результате чего происходит дезактивирование супрола. Одновременно несколько повышается -продуцирующая активность цит b558III. Фактически цит b558III очищает супрол от следов Hb и дезактивирyет этот липопротеин сыворотки высокой плотности, повышая его стабильность. Таким образом, проявляется "антиоксидантный" эффект цит b558III, предотвращающий продуцирование супролом и подавляющий перекисное окисление фосфолипидных остатков супрола супероксидными радикалами. Это имеет большое значение для сохранения стабильности супрола, соответственно и нормальной вязкости сыворотки.

Рис.4.

Под воздействием CCl₄ (рис 4, б) наблюдается повышение - продуцирующей активности супрола (31.4±3.2%, P < 0.03), что, возможно, связано с повышением "растворимости" супрола как липопротеина высокой плотности в гидрофобной среде CCl₄. Видимо, на начальных этапах экспериментального цирроза печени крыс под воздействием CCl₄ происходит повышение -продуцирующей активности и липидной пероксидации супрола с соответственным повышением вязкости сыворотки и возможным изменением гемодинамики. Эти обстоятельства вынуждают переоценить токсические эффекты CCl₄. С другой стороны, подавление -продуцирующей активности супрола, расщепление комплекса супрола с Нb и захват последнего цитохромом b558III являются новыми факторами "очищения" сыворотки, повышения стабильности липопротеина сыворотки высокой плотности - супрола и сохранения нормальной вязкости крови в целом. Исходя из того, что цит b558III локализован на внешней поверхности ЭМ [11], не исключается аналогичная роль цит b558III и в гетерогенной фазе (в ЭМ).

Институт биохимии им. Г. X. Бунятяна НАН РА

Литература

    1. Симонян М. А., Карапетян А. В., Бабаян М. А., Симонян М. А. - Биохимия. 1996. Т. 61. № 5. С. 932-938.
    2. Симонян Г. М., Симонян М. А., Карагезян К. Г. - ДНАН Армении. 2003. Т. 103. № 2. С. 151-153.
    3. Симонян Г. М., Бабаян М. А., Симонян Р. М., Симонян М. А. - Биол. ж. Армении. 1999. Т. 1. № 52. С. 18-21.
    4. Оксузян Г. Р., Симонян Р. М., Симонян М. А., Алексанян С. С. - Мед. наука Армении. 2001. Т. 41. № 2. С. 21-26.
    5. Оксузян Г. Р., Симонян Р. М., Бабаян М. А., Симонян М. А. - Мед. наука Армении. 2002. T. 42. № 2. С. 3-6.
    6. Алексанян Серг. С., Алексанян С. С., Симонян Г. М. - Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга. 2004. Т. 9. № 8. С. 198-200.
    7. Симонян Р. М., Симонян Г. М., Симонян М. А. - Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга. 2004. Т. 9. № 8. С. 72-79.
    8. Симонян Р. М. Новые факторы оксидативного повреждения компонентов крови. Автореф. канд. дис. Ин-т биохимии НАН РА. Ереван. 2004.
    9. Симонян М. А., Симонян Г. М. Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобрет. № 341 Армпатента. Ереван. 1997.
    10. Симонян М. А., Симонян Г. М., Симонян Р. М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия № 908 Армпатента. Ереван. 2001.
    11. Симонян Г. М., Симонян Р. М., Бабаян М. А., Карапетян А. В., Симонян М. А. - Мед. наука Армении. 2003. Т. 43, № 1. С. 30-38.