Reports-2005-Vol105-N2-Davtyan

МЕДИЦИНА

УДК 616-056: 616-097

Т. К. Давтян, С. А. Аветисян, академик Э. С. Габриелян, академик В. П. Акопян

Влияние йод-литий-a-декстрина (арменикума) на периодическую
активацию спонтанного и индуцибельного дыхательного взрыва
гранулоцитов и моноцитов при семейной средиземноморской лихорадке

(Представлено 22/XII 2004)

   Введение. С целью сочетания неспецифического антимикробного действия молекулярного и ионизированного йода с иммуномодулирующими свойствами отрицательно заряженных полисахаридов сконструирован комплексный препарат йод-литий-a-декстрин под названием "арменикум" (Арм) [1]. Пролонгированное отщепление молекул и ионов йода из комплексного полимера и его упорядоченная конформация способствуют антибактериальной, антивирусной активности и низкой токсичности препарата [2]. Арм обладает также выраженной иммуномодулирующей активностью [3, 4].
   Периодическая провоспалительная и прооксидантная активация нейтрофилов и моноцитов играет важную роль в реализации острофазного ответа при семейной средиземноморской лихорадке (ССЛ) [5-7]. Специфические мутации при ССЛ обнаружены в гене, кодирующем пирин, который экспрессируется в фагоцитирующих клетках, участвует в процессах регуляции апоптоза и синтеза ИЛ-1b [8-12].
   Целью настоящего исследования явилось изучение влияния Арм на индукцию спонтанного, хемотаксис-, фагоцитоз- и протеинкиназа С-опосредованного дыхательного взрыва нейтрофилов и моноцитов периферической крови у не получавших колхициновую терапию больных ССЛ.
   Материалы и методы. Была исследована периферическая кровь 12 больных ССЛ возрастной группы 18-27 лет. Больные не получали колхицин и не имели амилоидоз. Первая группа больных (n = 6) была исследована во время приступа, вторая (n = 6) - в межприступном периоде. Периферическую кровь забирали в пробирках, содержащих литий-гепарин (Vacuet, Greiner).
   Метод количественного определения дыхательного взрыва гранулоцитов и моноцитов основан на измерении флюоресценции единичных клеток при их инкубации с высокочувствительным флюоресцентным зондом - дигидрородамином 123 (DHR123), вступающим в реакцию с кислородсодержащими свободными радикалами (КСР) - супероксид анион, перекись водорода и гипохлорная кислота. Цитофлюориметрическое определение дыхательного взрыва моноцитов и нейтрофилов проводили при помощи тест-системы Bursttest (Orpegen Pharma). Для этого к 100 мкл цельной крови добавляли один из следующих препаратов: 20 нг/мл форбол-12-миристил-13 ацетата (PMA); 100 нг/мл синтетического пептида N-формилметионин-лейцин-фенилаланин (fMLP); 2×10⁷ опсонизированных и фиксированных формалином E. Coli; 20 мкл забуференного физиологического раствора - и пробы инкубировали 10 мин при 37^oС. После инкубации в пробы добавляли DHR123 и продолжали инкубировать при 37^oС в течение 10 мин. ДНК клеток окрашивали витальной краской - пропидий йодидом. Активность (% клеток, подвергающихся дыхательному взрыву) и интенсивность дыхательного взрыва (относительная способность единичной клетки продуцировать КСР, что представлено как геометрический средний номер канала флюоресценции - СНК) в отсутствие (спонтанный дыхательный взрыв) и в присутствии (индуцированный дыхательный взрыв) индукторов определяли на цитофлюориметре FACSCalibur^TM с пакетом программ CellQuest (Becton Dickinson) отдельно для каждой популяции клеток.
   Растворы Арм (производство ЗАО Арменикум, Ереван, Армения) и колхицина (Sigma) готовили непосредственно перед использованием, разводя препарат в физиологическом растворе и абсолютном этаноле соответственно. Аликвоты образцов цельной крови по 1 мл инкубировали в присутствии различных концентраций Арм и колхицина в течение 3 ч при 37^oС. После завершения инкубации и гематологического анализа крови проводили проточную цитофлюориметрию, как описано выше.
   При статистическом анализе различий между исследованными группами проводилась проверка вариационных рядов на нормальность распределения и однородность дисперсий (критерий Колмогорова - Смирнова, W- и F-критерий). В случаях, когда гипотеза нормальности отвергалась, использовались непараметрические критерии Уилкоксона - Манна - Уитни (P_y). В остальных случаях расчет проводился с помощью критерия Стьюдента (P_t) и парного T-критерия (P_p).
   Результаты. Арм в разведении 1:10-1:100 значительно подавляет активность и интенсивность как спонтанного, так и хемотаксис (fMLP)-, протеинкиназа С (PMA)- и фагоцитоз- (E. coli) индуцированного дыхательного взрыва нейтрофилов и моноцитов больных ССЛ в межприступном периоде (P_t < 0.04 и P_y < 0.03). В разведении 1:400 Арм подавляет активность и интенсивность хемотаксис-зависимого дыхательного взрыва моноцитов и нейтрофилов больных ССЛ в межприступном периоде (рис.).

Влияние арменикума на спонтанный и индуцибельный дыхательный взрыв
нейтрофилов и моноцитов больных ССЛ в зависимости от дозы. По оси абсцисс -
log₁₀ разведения арменикума, по оси ординат - активность дыхательного взрыва
клеток (%); C - спонтанный, F - fMLP-, P - PMA-, E - E. Coli-индуцированный
дыхательный взрыв.

Из представленных в табл. 1 и 2 данных следует, что если в популяции нейтрофилов выслеживается периодическое усиление (в межприступном периоде) и погашение (во время приступа) спонтанного и индуцибельного дыхательного взрыва, то в популяции моноцитов такая периодичность выражена довольно слабо. В популяции моноцитов наблюдается лишь некоторое уменьшение частоты хемотаксис-зависимого дыхательного взрыва и интенсивности PMA-зависимой продукции КСР единичным моноцитом во время приступа. Анализ переходной активации дыхательного взрыва клеток по следующему ряду: спонтанный дыхательный взрыв (С)®слабая стимуляция хемоаттрактантом - fMLP (F)®стимуляция агонистом протеинкиназы С - PMA (Р)®индукция фагоцитоза E. coli (Е) - показал, что в популяции нейтрофилов вероятность переходной активации хемотаксис-зависимого дыхательного взрыва у больных во время приступа снижается в 10 раз по сравнению с больными в межприступном периоде, в то время, как вероятность фагоцитоз-зависимой активации продукции КСР по ряду F®E - увеличивается в 10 раз. В популяции моноцитов, наоборот, у больных в межприступном периоде вероятность усиления продукции КСР при наличии хемотаксического сигнала снижается в 10 раз, в то время как вероятность фагоцитоз-зависимой активации продукции КСР по ряду F®E увеличивается в 10 раз.

Таблица 1
Влияние арменикума и колхицина на дыхательный взрыв нейтрофилов и моноцитов
больных ССЛ в межприступном периоде

Активность дыхательного взрыва

Интенсивность дыхательного взрыва (СНК)

Нейтрофилы

Спонтанный

fMLP

PMA

E. coli

Спонтанный

fMLP

PMA

E. coli

Контроль

11.2±2.5

57.1±13.9

98±0.8

99.6±0.1

108±9.7

343.5±93.2

1037±293

1536±380

Арм

11.6±0.9

41±9.5°

97.4±2

96.5±3.2

108.7±12.3

302.7±67.6

961.9±305.2

1734±446

Арм+Колх

40.5±15.2^•

47±13.6

46.6±12.1^•

51.7±13.2^•

172.5±10.7^•

205.6±45.8°

218.7±66.4^•

229.4±67^••

Моноциты

Контроль

19.4±4.5

35.5±10.8

64.7±13.8

73.5±18.2

117.7±12.4

209.6±67

345.1±92

464.2±117.3

Арм

14.3±3.1

23.1±7.1°

71.7±17.4

76.4±18

128.4±18.2

154.4±49.9

323.7±113.4

430.3±142.2

Арм+Колх

25.4±8.3

32.6±10.6

35.6±9.9^•

31.9±12.4^•

102.6±20.5

109.7±21.5°

116.7±25.1^•

110±28.3^•

Влияние арменикума и колхицина на переходную активацию нейтрофилов и моноцитов
в межприступном периоде ССЛ^а

Активность дыхательного взрыва

Интенсивность дыхательного взрыва (СНК)

Нейтрофилы

CàF

CàP

CàE

FàP

FàE

PàE

CàF

CàP

CàE

FàP

FàE

PàE

Контроль

P_t=0.005

P_t<0.0001

P_t<0.0001

P_t=0.01

P_t=0.01

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0.02

P_t=0.006

P_t=0.002

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0.01

P_t_CH

P_p=0.05

Арм

P_t=0.009

P_t<0.0001

P_t<0.0001

P_t=0.004

P_t=0.0006

P_tP_p_CH

P_t=0.01

P_t=0.01

P_t=0.002

P_t=0. 03

P_t=0.01

P_tP_p_CH

Арм+Колх

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.05

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.05

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

Моноциты

Контроль

P_t_CH

P_y=0.05

P_t=0.008

P_t=0.01

P_t_CH

P_p=0.01

P_t_CH

P_p=0.03

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0.01

P_t=0.005

P_t_CH

P_p=0.02

P_t=0.04

P_t_CH

P_y=0.05

Арм

P_tP_p_CH

P_t=0.006

P_t=0.004

P_t=0.03

P_t=0.02

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_t=0.04

P_t=0.02

P_t_CH

P_p=0.05

P_t_CH

P_p=0.05

P_tP_p_CH

Арм+Колх

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

Примечания. ° – P_p≤0.05; ^• – P_t или P_y≤0.05; ^•• – P_t или P_y≤0.001; при сравнении средних значений с необработанным контролем; ^a –результаты представлены как статистическая достоверность между средними ± SEM значениями спонтанного (С), fMLP- (F), PMA- (P) и E. coli-индуцированного (E) окислительного взрыва

Таблица 2

Влияние арменикума и колхицина на дыхательный взрыв нейтрофилов и моноцитов
больных ССЛ во время приступа

Активность дыхательного взрыва

Интенсивность дыхательного взрыва (СНК)

Нейтрофилы

Спонтанный

fMLP

PMA

E. coli

Спонтанный

fMLP

PMA

E. coli

Контроль

7.3±1.9

17.3±5.4

72±25.6

97.1±2.4

86.8±21.5

111.7±26.2

815±423

1234±334

Арм

9.1±4.3

11.7±4.1^•

68.3±30.3

66.3±33.1

84.4±15.2

84.4±27.2°

691.6±381.7

1293±644.2

Арм+Колх

35.2±12^•

29±15.6

39.2±12.1^••

41.7±23.2^••

139.2±34.6^•°

146±52.6

180.4±50.3^•••

205.6±54.8^•••

Моноциты

Контроль

16.3±4.7

26.2±5.7

68.8±9.6

69.5±8.1

100.7±20.1

201.6±54.4

243.5±49.2

321.2±78

Арм

13.4±3.9

15.8±4.1°

59.3±26

59.5±30.3

93.8±24.5

130.4±35.6°

247.2±101

265.3±125

Арм+Колх

24.5±12.4

34.1±10.5°

31.3±11.2°

28.7±8.5^••

135.7±15.9

169.4±36.4°

156.9±10.2^•

149.3±28^•

Влияние арменикума и колхицина на переходную активацию нейтрофилов и моноцитов
во время приступа ССЛ^а

Активность дыхательного взрыва

Интенсивность дыхательного взрыва (СНК)

Нейтрфилы

CàF

CàP

CàE

FàP

FàE

PàE

CàF

CàP

CàE

FàP

FàE

PàE

Контроль

P_t=0.04

P_t=0.006

P_t<0.0001

P_t=0.03

P_t<0.0001

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.005

P_t_CH

Py=0.05

P_t_CH

P_p=0.009

P_t_CH

Py=0.05

P_t=0.003

P_tP_p_CH

Арм

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0.02

P_t=0. 03

P_t=0. 04

P_t_CH

P_p=0.05

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0. 04

P_tP_p_CH

Арм+Колх

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

Моноциты

Контроль

P_t_CH

P_p=0.005

P_t=0.0005

P_t=0.0005

P_t=0.02

P_t=0.004

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.05

P_t=0.01

P_t=0.007

P_tP_p_CH

P_t_CH

P_p=0.03

P_tP_p_CH

Арм

P_tP_p_CH

P_t=0.03

P_t=0.03

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

Арм+Колх

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

P_tP_p_CH

Примечания. ° – P_p≤0.05; ^• – P_t или P_y≤0.05; ^•• – P_t или P_y≤0.001; ^•••– P_t или P_y≤0.0001 при сравнении средних значений с необработанным контролем; ^a –результаты представлены как статистическая достоверность между средними ± SEM значениями спонтанного (С), fMLP- (F), PMA- (P) и E. coli-индуцированного (E) окислительного взрыва

Таким образом, анализ вероятности переходной активации клеток по ряду C®F®P®E у больных ССЛ в межприступном периоде и во время приступа выявил выраженную периодичность изменения активности и интенсивности продукции КСР нейтрофилами, а также противоположную направленность периодичности переходной активации моноцитов и нейтрофилов.
Арм в разведении 1:400 подавляет активность и интенсивность хемотаксис-зависимого дыхательного взрыва моноцитов и нейтрофилов больных ССЛ как в межприступном периоде, так и во время приступа (табл. 1 и 2). В присутствии колхицина (10 мкг/мл) потенцируется ингибирующий эффект Арм на PMA- и E. coli-зависимую продукцию КСР. В то же время ингибирующее влияние Арм на хемотаксис-зависимый дыхательный взрыв моноцитов и нейтрофилов в присутствии колхицина значительно подавляется (табл. 1 и 2). У больных ССЛ в межприступном периоде Арм снижает вероятность продукции КСР PMA-стимулированным единичным нейтрофилом в 10 раз, но и повышает вероятность переходной активации нейтрофилов по ряду F®E и F®P от 10 до 100 раз. У этих же больных в присутствии Арм вероятность хемотаксис-зависимого дыхательного взрыва моноцитов и фагоцитоз-зависимой продукции КСР единичным моноцитом снижается в 10 раз, в то время как вероятность увеличения количества КСР-продуцирующих моноцитов при индукции фагоцитоза возрастает в 10 раз. У больных во время приступа Арм до 100 раз подавляет вероятность увеличения количества нейтрофилов при их стимуляции агонистом протеинкиназы С и при индукции фагоцитоза. При этом значительно подавляется вероятность хемотаксис-, протеинкиназа С- и фагоцитоз-индуцированной продукции КСР единичным нейтрофилом. У больных во время прступа вероятность переходного увеличения количества моноцитов и интенсивности хемотаксис-, протеинкиназа С- и фагоцитоз-индуцированной продукции КСР также снижается до 100 раз. При комбинированном действии колхицина и Арм вероятность переходной активации продукции КСР в присутствии fMLP, PMA и E. coli в обеих популяциях клеток больных ССЛ как в межприступном периоде, так и во время приступа снижается от 100 до 1000 раз (табл.2).
Таким образом, Арм подавляет активность и интенсивность хемотаксис-индуцированного дыхательного взрыва, а также вероятность переходной прооксидантной активации моноцитов и нейтрофилов больных ССЛ, что открывает новые возможности для улучшения существующих курсов лекарственной терапии при ССЛ.

Исследовательский центр "Арменикум"
Ереванский государственный медицинский университет им. М. Гераци

Литература

     1. Gabrielyan E.S., Mkhitaryan L.M. (eds.), ARMENICUM - Experimental and Clinical Studies, Gitutyun, Yerevan. 2001. 228 p.
     2. Давтян Т.К., Акопян И.С., Мхитарян Л.М., Габриелян Э.С. - Аллергология и иммунология. 2004. N 5. С. 121.
     3. Давтян Т.К., Мхитарян Л.М., Ароян А.А., Мкртчян Н.Р. - International J. Immunorehabilitation. 2002. N 4. P. 88-89.
     4. Davtyan T.K., Hakobyan I.S., Gabrielyan E.S. - 13th International Symposium on HIV & Emerging Infectious Diseases. 2004. PP2.15. P.177.
     5. Aganna E., Hammond L., Hawkins P.N., Aldea A., McKee S.A. Pools van Amstel H.A., Mischung C. - Arthritis Rheum. 2003. V. 49. P. 2632-2644.
     6. Arkwright P.D., McDermott M.F., Houten S.M., Frenkel J., Waterham, Aganna E., Hammond L.J., Mirakian R.M., Tomlin P.I., Vijaydural P.I., Cant A.J. - Clin. Exp. Immunol. 2002. V. 130. P. 484-488.
     7. Gummucio D.L., Diaz A., Schaner P.A.B., Richards N., Babcock C.B.S., Sehaller M.B.S., Cesena T.B.S. - Clin. Exp. Rheumatol. 2002. V. 20. P. 45-53.
     8. Алексанян Ю.Т., Арутюнян В.М., Давтян Т.К., Акопян Г.С. - Иммунология. 1999. N 2. С. 9-13.
     9. French FMF Consortium. - Nat. Genet. 1997. V. 17 P. 25-31.
     10. International FMF Consortium. - Cell. 1997. V. 90. P. 797-807.
     11. Schattner A., Gurevitz A., Zemer D., Hahn T.Q. - J. Med. 1996. V. 86. P. 205-210
     12. Stehlik Ch., Reed J.C. - J. Exp. Med. 2004. V. 200. P. 551-558.