УДК 577.155.3, 577.112.4

   Аргиназа (К 3.5.3.1.) катализирует расщепление аргинина на мочевину и орнитин. Кроме участия в орнитиновом цикле, аргиназа, как известно, играет важную роль и во многих других процессах, происходящих в различных тканях живых организмов [1,2]. В последние годы интерес к аргиназе был стимулирован демонстрацией ее участия в метаболизме окиси азота [3,4].
   Изучение структуры и функции аргиназ, выделенных из печени различных млекопитающих, показало, что хотя эти ферменты отличаются по структурным особенностям, ряду кинетических и физико-химических свойств, основные закономерности строения и функционирования у них сходны [5]. Так, печеночные аргиназы млекопитающих не содержат важных для активности сульфгидрильных групп [6-8]. В состав активного центра этих ферментов входят остатки гистидина [7-9]. Остатки триптофана и тирозина расположены в гидрофобных участках макромолекулы, которые удалены от активного центра аргиназы [8,10]. В области активного центра аргиназы печени крыс, который расположен в углублении на расстоянии 15 Å от поверхности молекулы, кроме остатков гистидина имеются карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот [11]. Изучение инактивации аргиназы печени быка при химической модификации карбоксильных групп фермента водорастворимым карбодиимидом показало, что около 20% активности сохраняется даже при использовании высоких концентраций реагента [12]. Ингибирование носит неконкурентный характер и значительно более эффективно происходит в присутствии этилового эфира глицина.
   В настоящей работе рассматривается инактивация аргиназы в присутствии гидроксиламина (ГА). Гидроксиламмониевый ион реагирует с активированными карбоксильными и карбонильными группами белков в растворе [13-16] и по сравнению с довольно крупной молекулой использованного нами ранее карбодиимида имеет бóльшие возможности для доступа к чувствительным функциональным группам, расположенным в области активного центра аргиназы.
   В опытах использовали лиофилизированный препарат аргиназы печени быка фирмы "Reanal" (Венгрия). К раствору фермента (1 мл) в концентрации 4.2·10^-6М на 0.05 M глициновом или фосфатном буферах добавляли водный раствор ГА (0.4 мл), приготовленный непосредственно перед употреблением, и инкубировали при комнатной температуре (20^oС) в течение часа. Затем пробу разбавляли в 10 раз 0.05 М глициновым буфером (рН 9.5) и определяли аргиназную активность по методу Ратнер, как описано ранее [8]. Для измерения спектров флуоресценции (ФЛ) пробы разбавляли в 8 раз дистиллированной водой (концентрация белка в растворе 0.15 мг/мл). Спектры флуоресценции измеряли при комнатной температуре (20^oC) на спектрофлуориметре Cary Eclipse фирмы "Varian" с персональным компьютером при длинах волн возбуждения 280 и 297 нм в 1-сантиметровых кварцевых кюветах при ширине щели возбуждения и испускания 5 и 10 нм соответственно. Использовали препараты L-аргинина, L-лизина, глицина фирмы "Reanal" (Венгрия), солянокислый гидроксиламин марки ч.д.а. Остальные реактивы марки ч.д.а. или х.ч. отечественного производства.

   Инактивация аргиназы при взаимодействии с ГА происходит в первые 20 мин, и дальнейшая инкубация почти не влияет на активность фермента. На рис. 1,А показана кинетика инактивации аргиназы в присутствии 10 mM ГА при рН 7.6. Как видно из рисунка, инактивация фермента представляет собой двустадийный процесс, каждая из стадий которого протекает по реакции псевдопервого порядка. Это означает, что в ходе реакции с ГА два типа чувствительных к реагенту функциональных групп фермента модифицируются с различными скоростями. Взаимодействующие с реагентом карбоксильные или карбонильные группы, находящиеся в активированном состоянии, возможно, расположены вблизи от активного центра аргиназы или входят в его состав. Активация карбоксильных групп происходит, по-видимому, за счет взаимодействия с другими функциональными группами белковой молекулы, находящимися в непосредственной близости [14].
   Снижение каталитической активности аргиназы в присутствии ГА зависит от рН раствора. Изучение влияния рН на инактивацию аргиназы проводили в области рН 6.8-11. При концентрации ГА 12 mM в растворе с рН 6.8 в течение часа активность снижается на 60%. С увеличением значений рН скорость инактивации уменьшается, и при рН 9.8-11 инактивации не наблюдается (рис. 1,Б). Как видно из рисунка, сигмоидная кривая этой зависимости имеет точку перегиба при рН 8.7, т. е. процессы инактивации связаны с ионизирующейся группой фермента с рK_a 8.7. При низких значениях рН эта функциональная группа находится в протонированном состоянии. Депротонирование ее с увеличением значений рН делает фермент нечувствительным к реагенту. Учитывая, что значения рK_a карбоксильных групп в белках находятся в области 2-4.5, можно предположить, что в области активного центра вблизи от карбоксильной группы находится протонированная группа, роль которой заключается, по-видимому, в поддержании карбоксильной группы в активированном состоянии. Для идентификации этой функциональной группы требуются дополнительные исследования. Нельзя исключить также влияние возможных конформационных изменений в области активного центра аргиназы, происходяших при изменении значений рН. Как известно, в кислой среде (рН 6.5 и ниже) нативная конформация аргиназы нарушается и фермент теряет функциональные свойства [17]. Принимая во внимание вышеизложенное, дальнейшие эксперименты проводились при рН 7.4-7.6.
   Степень инактивации фермента зависит от концентрации реагента. При высоких концентрациях ГА аргиназа теряет активность почти полностью. На рис. 2 показана полулогарифмическая зависимость относительной остаточной активности аргиназы от концентрации ГА (рН 7.5). Анализ зависимости скорости инактивации от концентрации ингибитора позволяет предположить, что снижение активности аргиназы связано с модификацией быстрореагирующих, важных для активности карбоксильных групп. Характер ингибирования аргиназы ГА, определенный с помощью метода Лайнуивера-Бэрка, конкурентный. Константа ингибирования, определенная методом Диксона, в условиях данного эксперимента равна 16 mM (рис. 3). Присутствие конкурентного ингибитора L-лизина в растворе частично защищает фермент от инактивации в данных условиях (рис. 2). Очевидно, часть из модифицируемых этим реагентом функциональных групп находится вблизи от участка активного центра, с которым связывается L-лизин.

   Для проверки влияния модификации ГА на конформационное состояние молекулы аргиназы были измерены спектры ФЛ растворов фермента до и после воздействия реагента. Инактивацию аргиназы проводили при рН 6 (0.05 M фосфатный буфер) и концентрации ГА 48 mM в растворе в течение 60 мин при комнатной температуре. Максимум спектра ФЛ исследуемого препарата аргиназы при длине волны возбуждения (l_возб) 297 нм находится при 338 нм, что было показано ранее [18,19]. При длине волны возбуждения 280 нм интенсивность ФЛ значительно возрастает, а максимум ФЛ смещается в коротковолновую область до 336-337 нм. Небольшое смещение положения максимума ФЛ в коротковолновую область указывает на то, что флуоресценция остатков тирозина, очевидно, вносит определенный вклад в процессы ФЛ аргиназы, однако спектр ФЛ при l_возб 280 нм, в основном, определяется триптофановой компонентой. Согласно литературным данным [20], число остатков тирозина на молекулу аргиназы печени быка в 3.5 раза больше, чем остатков триптофана. Возможно, в данных условиях в молекуле аргиназы происходит миграция энергии с остатков тирозина на триптофан. Необходимо также учитывать, что в белках имеет место тушение флуоресценции находящимися в непосредственной близости от хромофоров группами, обладающими тушащими свойствами, среди которых аминогруппы, карбоксильные группы, имидазольная группа гистидина и т.п. [21]. Отношение интенсивностей ФЛ в максимуме при длинах волн возбуждения 280 и 297 нм () составляет 2.48. Отношение относительных квантовых выходов ФЛ аргиназы (q₂₈₀/q₂₉₇) при указанных длинах волн возбуждения равно 2.3.
 

   В результате взаимодействия с ГА интенсивность ФЛ растворов аргиназы для двух длин волн возбуждения снижается одинаково - на 11.5%, однако положение максимумов и отношение максимальных интенсивностей ФЛ не меняется, = 2.47 (рис. 4). Несколько уменьшается лишь q₂₈₀ / q₂₉₇ = 2.2. Таким образом, параметры ФЛ растворов аргиназы существенно не меняются, т. е. изменений микроокружения остатков триптофана и тирозина аргиназы, согласно полученным данным, в этих условиях не происходит. Снижение интенсивности ФЛ аргиназы в результате взаимодействия с ГА можно объяснить увеличением числа тушащих групп на поверхности молекулы белка. При модификации гидроксиламином, возможно, имеют место некоторые изменения конформации в области активного центра аргиназы, однако они не затрагивают ту часть молекулы белка, в которой расположены остатки тирозина и триптофана. Полученные данные еще раз подтверждают наличие в составе этого фермента устойчивых к различным воздействиям гидрофобных участков, в которых аминокислотные остатки связаны друг с другом прочными связями, поддерживающими вторичную и третичную структуру, что обеспечивает высокую стабильность молекулы аргиназы в организме в различных экстремальных условиях.
   Автор выражает благодарность Ш. А. Маркаряну за содействие и помощь при измерении спектров флуоресценции.

     Ереванский государственный университет