УДК 577.15

   Биологически активные пептиды, выделенные из секреторных гранул нейрогипофиза, образуются из высокомолекулярных белков-предшественников, подвергающихся ряду посттрансляционных модификаций (глюкозилированию, фосфорилированию и т.п.). Aкадемиком А. А. Галояном показано, что эти пептидные фракции на препаратах in vivo и in vitro обладают мощным иммуностимулирующим эффектом [1,2].
   В организме иммунная и нервная системы взаимодействуют друг с другом. В здоровом организме имеет место модулирование иммунной реактивности нервами, иннервирующими лимфоидные органы; с другой стороны, медиаторы иммунной системы оказывают влияние на функции мозга. Примером могут служить инфекционные болезни и травматические повреждения ЦНС, аутоиммунные и нейродегенеративные болезни, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Установлено, что в патогенезе вышеуказанных болезней важную роль играют ферменты углеводно-фосфорного обмена, когда нарушаются процессы фосфорилирования-дефосфорилирования белков [3-5].
   В настоящее время известно уже целое семейство гипофизарных и гипоталамических гормонов, вовлеченных в регуляцию обмена фосфопротеинов разными механизмами действия [6,7], некоторые из них тесно связаны с каскадом реакций, запускаемых сАМР [8-10]. Регулируя гликолитические процессы фосфорилазы, эти нейропептиды играют ключевую роль в процессе метаболизма углеводов, переводя их из запасной формы в метаболитически активную.
   Превращение крахмала и других сходных с ним глюкозосодержащих полисахаридов (гликогена) также катализируется фосфорилазами. Реакция представляет собой фосфоролиз с отщеплением глюкозы и образованием глюкозо-1-фосфата. Будучи первым звеном в катаболической цепи реакций фосфорилаза является объектом воздействия разнообразных регуляторных механизмов.
   Задачей настоящего исследования было выявить биологический спектр действия пролин-богатых пептидов мозга (пептид с 15 аминокислотными остатками - пролин-богатый пептид-1 (ПБП-1 или галармин), пептид с 14 аминокислотными остатками -N 174 и пептид с 10 аминокислотными остатками с С-концевым свободным пролином -N 173) на активность гликогенфосфорилазы (ГФ) - одного из ключевых ферментов в регуляции гликогенолиза в животных тканях. Учитывая, что активность гликогенфосфорилазы непосредственно связана со статусом ее фосфорилированности, в опытах in vitro определялась активная ГФ (ГФ-а), как на уровне гомогената, так и на чистом ферменте.
   Опыты проводились на тканях белых крыс линии Висмар массой 100-120 г, а также на чистом ферменте, выделенном из мышц кролика, из расчета 1 мг фосфорилазы а в 1 мл дистиллированной воды.
   Животных декапитировали, ткани быстро промывали дистиллированной водой на холоду и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в пятикратном объеме ТЭМ-буфера (0.04 М трис - 0.002 М ЭДТА - 0.01 М меркаптоэтанол), рН 6.8. Активность фосфорилазы в обоих случаях (КФ 2.4.1.1) определяли по Иллингворту и Кори [11]. Исследуемый материал предынкубировали 2 мин при 30^o C 0.1 мл 4% водного раствора гликогена, 0.1 мл ТЭМ-буфера, 0.1 мл исследуемого пептида и далее для хода реакции добавляли 0.1 мл 64 мМ глюкозо-1-фосфата. Через 5 мин реакцию останавливали 1.6 мл охлажденной 5% ТХУ. Активность фермента определяли по убыли неорганического фосфора в реакционной смеси по методу Таусски и Шора [12].
   Aмилолитическая и фосфоролитическая активность тканей отдельных органов животных неодинакова. Гликогенфосфорилазы из разных источников отличаются не только по уровню активности, но и по чувствительности к разным эффекторам, что, по-видимому, связано с особенностями четвертичной структуры фермента, определяющей его тканевую гетерогенность [13]. Поскольку имеющиеся литературные сведения не содержат информации о возможном влиянии пептидов, выделенных из нейросекреторных гранул нейрогипофиза крупного рогатого скота, на гликогенфосфорилазную активность, нами было изучено воздействие галармина и его производных, взятых в физиологических (и субфизиологических) концентрациях, на активность фермента печени, мышц и мозга белых крыс и очищенном ферменте (таблица). Активность ГФ-а под действием этих биологически активных веществ менялaсь по-разному.

   Опыты с добавлением галармина, N 173, N 174 на печеночную ткань показали существенное подавление (66-58%) активности фермента в концентрации 46 g. Ингибирующий эффект этих пептидов значительно ослабевал при концентрации 26 и 13 g (соответственно 47 и 30%). Понижение активности ГФ-а говорит о переключении метаболических механизмов на преимущественное депонирование гликогена. Особая роль печени в обмене гликогена обуславливает наличие определенной специфики регуляторных свойств гликогендефосфорилазы в этом органе. Общеизвестно, что ГФ, являясь фосфопротеином, находится под контролем соответствующих протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз, осуществляющих фосфорилирование и дефосфорилировaние. Не исключено, что в этом случае сдвиги в активности фермента происходят вследствие нарушения деятельности вышеуказанных ферментов.
   Изменения в активности мозговой фосфорилазы a под действием пептидов менее выражены и характеризуются разнотипностью в картине регулирования. Если ударные дозы пептида 46 g ингибируют активность фермента на 13% и 24%, то при концентрации 23 g активирование ГФ-а невелико (10-6%). В то же время абсолютная величина активности фермента под действием низких концентраций (13 g) практически не отличается от контрольных величин. По-видимому, в данной ткани эти пептиды осуществляют не только регулирующую, но и протекторную функцию.
   Аналогичные исследования по выявлению действия указанных пептидов на ГФ-а были проведены на мышечной ткани белых крыс. Получена следующая картина: галармин и его производные в количестве 46 и 26 g в известной мере активировали фермент мышц, слабый активирующий эффект прослеживался в отношении ГФ-а при добавлении пептидов в кoличестве 13 и 26 g. Как видим, здесь наблюдается корреляция между активностью фермента и концентрацией пептида. По-видимому, такое активирование фермента связано с изменением статуса его фосфорилированности, т.е. переходом неактивной ГФ в ГФ-а. Накопление ГФ-а должно способствовать усилению деградации гликогена в мышцах животных.
   Для полной характеристики воздействия исследуемых полипептидов на фосфорилазную активность наряду с мышечными тканями крыс нами был использован также коммерческий фермент фосфорилазы а, выделенный из мышц кролика (рисунок). Учитывая описанный выше эффект активации, можно было предположить, что подобный эффект мог быть получен и на очищенном ферменте. Однако, как показали экспериментальные данные, галармин и его производные в большинстве случаев выступают ингибиторами этого фермента. В частности, как видно из кривой на рисунке, высокие концентрации подавляют активность вдвое, низкие - на 20-30%, а концентрации 1.5, 0.55 и 0.001 g фактически не действуют на уровень ферментативной активности. Такое расхождение в полученных результатах относительно тканевого и чистого фермента можно объяснить в одном случае прямым влиянием галармина на фермент, в другом, на уровне гомогената, - возможным участием каскадной системы сАМР.

 Действие галармина на активность очищенной фосфорилазы а. По оси абсцисс: К - контроль,
галармин в g. По оси ординат: активность фосфорилазы а в E  ([(мк моль Р)/(мг белок/мин)]);
Количество опытов - 8.

   Экспериментальные данные по действию пептидов на ГФ-a разнородны и с трудом поддаются систематике и обобщению. Весьма вероятно, что в клетке ГФ ее киназа и фосфатаза образуют ансамбль функционально связанных белков, гибко реагирующих на изменения внутренней среды.
   Большинство приведенных нами данных свидетельствуeт о том, что исследуемые пептиды могут служить эффективными регуляторами ГФ, входящей как одно из ведущих звеньев в сложную каскадную системy углеводно-фосфорного обмена.

   Институт биохимии им. Г. Х. Бунятяна НАН РА