УДК 577.112.612

   Аспартаттрансаминаза (АСТ) играет важную роль в синхронизации энергетического и азотистого обмена, осуществляемого на уровне митохондрий (МХ). Функционирование фермента связано с механизмами обмена азотистыми и безазотистыми веществами между митохондриальным матриксом и цитоплазмой [1]. Конкурируя с цитратсинтазой за оксалоацетат (ОА), АСТ при обеспечении цикла Кребса ацетил-СоА генерирует ОА, а при дефиците замыкает цикл, генерируя кетоглутарат (КГЛ). Подобное шунтирование цикла переаминированием включает и выключает окисление сукцината, генерирующего восстановительные эквиваленты для синтеза глутамата (ГЛУ). Генерирование НАДН сукцинатом блокирует вход ацетил-СоА в цикл, способствуя трансаминированию ГЛУ.
   Таким образом, осуществляется реципрокное окисление сукцината, что прослеживается по сукцинатзависимому (СЗ) поглощению Ca²⁺ МХ и гомогенатами тканей. Шунтирование цикла Кребса переаминированием повышает вклад в окисление янтарной кислоты [2,3], оказывает сильное регуляторное влияние на включение в цикл жирных кислот [4] и на использование углеводов в цитозоле. О. И. Писаренко [5-7] показана взаимосвязь между метаболизмом ГЛУ и аспартата, синтезом АТФ и стабилизацией работы сердца в условиях его гипоксической остановки и реперфузии. Cнижение уровня ГЛУ сопряжено с образованием КГЛ и усилением субстратного фосфорилирования в МХ [8,9].
   Сукцинат по интенсивности окисления превосходит НАД- зависимые субстраты. При его окислении МХ поглощают Ca²⁺ [10,11]. ГЛУ и КГЛ уступают ему в этом. Они разнонаправленно воздействуют на окисление сукцината: ГЛУ стимулирует процесс, по-видимому, за счет устранения ОА, а КГЛ тормозит [12-15]. Тормозящее действие КГЛ сопряжено с повышением эффективности фосфорилирования, дыхательного контроля и АДФ/О. Это явление воспроизводится на МХ и гомогенатах сердца и печени разных животных, прослеживается по СЗ дыханию, восстановлению НАД и поглощению Ca²⁺. По-видимому, ограничение КГЛ окисления сукцината, подобно его активации ГЛУ, может реализоваться через ОА. Такой подход позволяет по влиянию на окисление сукцината субстратов переаминирования наблюдать за обратимостью реакции. В качестве чувствительного теста удобен захват Ca²⁺ МХ.
   В работе исследовали влияние ГЛУ и КГЛ на СЗ поглощение Ca²⁺ в МХ сердца голубя и гомогенатах сердца и печени крысы.
   В работе использовали 20 сизых голубей, из сердец которых выделяли МХ, а также 30 крыс линии Вистар массой 200 г. Из органов крыс получали солевые гомогенаты. Для выделения МХ из сердечной мышцы использовали общепринятую среду (сахароза 300 мкМ, Нереs 10 мМ, ЭДТА 0.5 мМ, рН 7.4) в соотношении ткань: среда 1 : 10 [16]. Среду суспендирования (без ЭДТА) использовали в соотношении ткань: среда равном 10 : 1.
   Приготовление гомогената сердечной ткани. Сердце после забоя животного помещали в ледяной раствор следующего состава: 125 мМ КС1, 10 мМ Hepes, 1 мМ ЭДТА, рН 7.65. Желудочки после иссечения предсердий трижды промывали вышеуказанной средой, взвешивали и переносили на охлаждаемое льдом часовое стекло. Cреду гомогенизации обогащали ГЛУ 5 мМ с целью предохранения МХ от повреждающего влияния продуктов перекисного окисления [13]. Среду добавляли к сердечной мышце в соотношении 3:1. Тщательно размельченную мышцу растирали (60 с) в неплотном стеклянном гомогенизаторе с помощью тефлонового пестика. Гомогенат фильтровали через слой капрона, отмечали его конечный объем. Препарат готов к измерению через 10 мин после забора сердца. Гомогенат (30-40 мг белка/мл) хранили на льду не более 30 мин. Образцы препарата вносили в среду инкубации по 25 мкл на 1 мл среды.
   Приготовление гомогената печени. Процедуры подробно описаны в [14,17]. После декапитации печень быстро извлекали и помещали в ледяную среду гомогенизации: 120 мМ КСl, 10 мМ Нepes, рН 7.5. ЭДТА и ГЛУ не добавляли. Гомогенат фильтровали через двойной слой капрона. Для измерения H⁺/Ca²⁺ обмена использовали 200 мкл гомогената с cодержанием белка в 60-70 мг/мл.
   Поглощение ионов Ca²⁺ в митохондриях   регистрировали по противофазному изменению H⁺ в среде инкубации с помощью водородного электрода. CaCl₂ добавляли порциями по 200 нмолей до спонтанного выброса [14,15]. Сумма поглощенных катионов характеризует Ca²⁺ -емкость. По достижении определенного предела возникает спонтанный выброс накопленного Ca²⁺. Показано [16,17], что интенсивности входа и выхода Ca²⁺ в пробах с и без АДФ различаются. Измерение Ca²⁺ -емкости проводили при окислении субстратов с АДФ и без нее [13,15,16]. Оценивали Ca²⁺ -емкость до и после синтеза АТФ.
   Определение скорости синтеза АТФ из АДФ. Измерение проводили по скорости убыли H⁺ (защелачиванию среды) после добавления АДФ.
   Инкубационная среда для выделенных МХ сердца голубя содержала 100 мМ сахарозы, 60 мМ КС1, 1.5 мМ КН₂РО₄, 1.5 мМ Tris-буфер, рН 7.4; для тканевых гомогенатов сердца и печени крысы - 120 мМ КСl, 1 мМ КН₂РО₄, 1 мМ Hepes, рН 7.4, t=25^o C. Субстраты окисления с концентрациями указаны в подписях к рисункам. Везде АДФ добавляли по 200 мкМ, CaCl₂ - по 200 мкМ. МХ и гомогенат вносили в исследуемую среду (объемом в 2 мл) с заранее добавленным субстратом окисления. Измерения на тканевых препаратах проводили в течение не более 30-45 мин после их получения. Во всех исследованиях уровень Ca²⁺ -емкости и скорость синтеза АТФ при окислении на сукцинате приняты за 100%.
   Белок измеряли методом Лоури [18]. Результаты обрабатывали по критерию Стюдента и методом парных сравнений (критерий Вилконсона U) [19].
   На рис. 1,2 и в табл.1,2 представлены результаты исследования действия ГЛУ и КГЛ на СЗ накопление Ca²⁺ выделенными МХ сердца голубя, а также гомогенатами сердца и печени крысы. Показана разнонаправленность действия исследованных субстратов: ГЛУ активирует, а КГЛ тормозит процесс. Выявлено, что КГЛ устраняет вызванную ГЛУ активацию процесса. С другой стороны, ГЛУ в превышающих концентрациях препятствует этому блокированию.
   Из рис.1,а видно, что МХ сердца голубя при дыхании на сукцинате поглощают гораздо больше Ca²⁺, чем на ГЛУ или КГЛ. СЗ поглощение Ca²⁺ усиливается ГЛУ и тормозится КГЛ (см. табл.1). Примечателен сам характер действия субстратов: ГЛУ (0.6-1мМ) вызывает активацию окисления во много раз больших количеств сукцината (2.5-5мМ) [11]. Прирост поглощения Ca²⁺ варьирует от 96 до 425%, составляя в среднем 294%. Торможение процесса КГЛ инициируется его относительно большими (5-10 мМ) к сукцинату концентрациями. При соотношении субстратов 1:2 процесс активируется незначительно или не изменяется. Активирующее действие ГЛУ в МХ сердца голубя наблюдается и в условиях их энергизации, т.е. после синтеза АТФ из добавленной АДФ (рис.1,б). Примечательно, что КГЛ устраняет действие ГЛУ.