БИОХИМИЯ

УДК 577.15

Л. П. Тер-Татевосян, Л. В. Саркисян, И. Г. Асланян, академик А. А. Галоян

Действие галармина и его производных на активность неорганической
пирофосфатазы и щелочной фосфатазы органов белых крыс

(Представлено 8/IХ 2003)

   Изучение ферментативных процессов углеводно-фосфорного обмена и их регуляция в процессе развития организма имеет важное значение для выявления ряда закономерностей общего биологического характера. Фосфомоноэстеразы по праву можно отнести к числу самых распространенных ферментов, осуществляющих в организме важную физиологическую функцию ввиду участия в биохимических реакциях обмена веществ в процессе фосфорилирования и дефосфорилирования. Динамику становления ферментативной системы трудно понять без учета химических реагентов, в том числе эффекторов биологического катализа - гормонов.
   Выделенные А. Галояном и сотр. из нейросекреторных гранул нейрогипофиза быка пролин-богатые полипептиды (ПБП), обладающие выраженными иммуномодулирующими, нейропротекторными свойствами, представляют несомненный интерес для исследования фосфомоноэстераз, которые по сведениям некоторых авторов могут быть вовлечены в патологию ряда нейродегенеративных болезней [1].
   В настоящем исследовании использованы полипептиды, состоящие из 10-15 аминокислотных остатков: пептид с 15 аминокислотными остатками - пролин-богатый пептид-1 (ПБП-1) (Ala-Gly-Ala-Pro-Glu-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Gln-Pro-Gly-Val-Tyr), названный галармином; пептид с 14 остатками - пептид 174 (Ala-Gly-Ala-Pro-Glu-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Gln-Pro-Gly-Val); пептид с 10 аминокислотными остатками с С-концевым свободным пролином - пептид 173 (Ala-Pro-Glu-Pro-Ala-Gln-Pro-Ala-Gln-Pro).
   Цель работы - изучить влияние вышеуказанных пептидов на активность фосфомоноэстеразы 1 - щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) и неорганической пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1) различных органов белых крыс в условиях in vitro.
   Были ипользованы те концентрации пептидов, которые в условиях in vivo оказались эффективными при некоторых патологиях (поражение центральной нервной системы, гемисекции, отравление змеиными ядами и болезни крови). [1].
   Опыты были проведены на печени, мозге и почках белых крыс (самцов) весом 100-120 г. Животных декапитировали, на холоду извлекали исследуемые органы и гомогенизировали определенное количество ткани в дистиллированной воде микроизмельчителем типа Уоринга. Активность неорганической пирофосфатазы определяли по методу Геппеля [2]. Реакционная смесь состояла из 0.01 М пирофосфата Na в мединаловом буфере (рН 7.2) и определенного количества гомогената для разных тканей. 1 мл гомогената содержал 30-40 мг свежей ткани. Активность неорганического фосфора определяли фотометрически при длине волны 630 нm, кювет 0.5 см.
   Инкубацию проводили в течение одного часа при температуре 370С. После инкубации приостанавливали реакцию 2 мл 40% трихлоруксусной кислоты и в безбелковом фильтрате определяли неорганический фосфор по методу Лоури и Лопеса [3].
   Активность щелочной фосфатазы определяли методом Шлыгина и Михлина [4]. В качестве субстрата использовали пара-нитрофенилфосфат ("Reanal") в концентрации 2·10-3М в мединаловом буфере (рН 9.6). Об активности фермента судили по нарастанию количества пара-нитрофенола в течение 30 мин при 300С.
   Активность очищенного фермента щелочной фосфатазы из тонких кишок цыплят (фирмы "Reanal") определяли так же, как и активность тканевой щелочной фосфатазы (рН 9.6). Реакцию приостанавливали 1 мл 30% ТХУ, окраску восстанавливали слабой щелочью. Интенсивность окраски фотометрировали при длине волны 420 нm, кювет 0.5 мм.
   В первой серии опытов мы исследовали действие галармина и его производных в определенном диапазоне доз на активность неорганической пирофосфатазы в печеночной ткани (табл.1). Как показали полученные результаты, высокие дозы пептидов повышают ферментативную активность в среднем на 50%, низкие - на 15%, т.е. в данной ткани прослеживается четкая корреляция между концентрацией пептида и активностью исследуемого фермента.
   В почечной ткани активация неорганической пирофосфатазы гипоталамическими пептидами прослеживается при всех использованных количествах, достигая максимальной величины при воздействии пептида 174 (94%).

Таблица 1

Действие галармина и его производных на активность неорганической пирофосфатазы
органов белых крыс (E = [(мкMP)/г,тк.,мин]), n = 7

   Противоположная картина наблюдается в мозговой ткани: галармин в дозах 46 и 23 g резко ингибирует пирофосфатазную активность (36%). Пептиды 174 несколько слабее подавляют фермент (25%), пептид же 173 при сравнении с контрольными животными не оказывает воздействия на пирофосфатазную активность.
   Таким образом, данные табл.1 показывают, что галармин и его производные являются стимуляторами неорганической пирофосфатазы печеночной и почечной тканей крыс, в то же время для фермента мозговой ткани эти пептиды выступают в роли ингибиторов.

 Таблица 2

Действие галармина и его производных на активность щелочной фосфатазы органов белых
крыс (E = [(мкMP)/г,тк.,мин]), n = 7

   Во второй серии опытов исследовалось действие тех же полипептидов на щелочную фосфатазу печени, почек и мозга крыс (табл.2). Как видно из таблицы, для печеночной ткани характерна однозначная активация фермента при всех используемых дозах пептида. Концентрационная зависимость каталитической активности щелочной фосфатазы почек от исследуемых пептидов определялась в диапазоне 23-46g. Все пептиды четко ингибируют фермент во всех концентрациях. Стойкую устойчивость к действию всех использованных доз гипоталамических пептидов проявляет щелочная фосфатаза мозга.
   Из литературы известно, что щелочная фосфатаза слизистой тонких кишок некоторых животных обладает высокой ферментативной активностью [5,6]. В этом аспекте интерес представлялo воздейтвие биологически активных веществ на частично очищенный фермент слизистой тонких кишок цыплят для сравнения с ферментом гомогената.
   Данные этой серии экспериментов показали (табл.3), что щелочная фосфатаза слизистой кишок сильнее подавлялась малыми дозами пептида, т.е. для частично очищенного фермента ингибирующий эффект действующего вещества находится в обратной зависимости от концентрации, что, вероятно, связано с наличием нативных протекторов в очищенном препарате кишечной щелочной фосфатазы.

Таблица 3

Действие галармина и его производных на активность частично очищенного фермента
щелочной фосфатазы из слизистой кишечника цыплят (E = [(мкMP)/мг белка, мин]), n = 6

   Приведенные нами данные, касающиеся действия гипоталамических пептидов на активность исследуемых ферментов, показывают, насколько неоднозначно их воздействие. Возникает вопрос, каким механизмом осуществляется их регуляция и какова природа фактора, блокирующего или активирующего ферментативную активность.
   Щелочная фосфатаза, выделенная из ряда источников, по утверждению многих авторов, принадлежит к металлоэнзимам. Известно также, что все аминокиcлоты в той или иной степени могут образовывать с ионами металлов хелатные комплексы, принимая непосредственное участие в образовании комплексов ионов металлов с белками [7]. В молекуле фермента, а именно в его аллостерических и активных участках, под действием полипептидов происходят некоторые структурно-конформационные изменения, в результате чего фермент проявляет различную чувствительность по отношению к регулятору.
   Кажущееся парадоксальным повышение активности пирофосфатазы под влиянием всех трех пептидов в печени и почках зависит, вероятно, от деятельности SH-групп, играющих важную роль как в проявлении активности фермента, так и ее регуляции. SH-группы, соединяясь с пептидами, могут повышать активность фермента по тому же механизму, что и в соединениях с тяжелыми металлами [8]. Возможно, в механизме действия пептидов на ферментативную деятельность существуют и другие пути.
   По мнению академика А. Галояна, в одних случаях это может быть С-концевой тирозин ПБП-1, который наряду с серином и гистидином является точкой присоединения аниона фосфата, в других - наличие в пептиде четырех пролиновых остатков, обеспечивающих активацию ферментативной деятельности.
   Представленный материал говорит о возможной ферментативной регуляции щелочной фосфатазы и пирофосфатазы новыми гипоталамическими пептидами, обеспечивающей уровень их функциональной активности.

   Институт биохимии им. Г. Х. Бунятяна НАН РА

Литература

   1. Galoyan A. Armen. In: Brain Neurosekretory cytokines, Immune Response and Neuronal Survival. Kluwer Academic Publishers. 2004.
   2. Heppel L. A. - Methods in Enzymology, 421, New York. 1955. V. 2. P. 570.
   3. Lowry O. H., Lopez J. A. - J. Biol. Chem. 1946. V. 162. N3. P. 421.
   4. Шлыгин Г. К., Михлин С. Я. - Вопросы мед. химии. 1955. N1. C. 461.
   5. Simpson R. T., Vallee B. L. - Ann N. Y. Acad. Sci. 1963. V. 166 N2. P. 670-689.
   6. Адунц Г. Т., Саркисян Л. В. - Биол. ж. Армении. 1983. T. 35. N9. C. 769.
   7. Hanson A. W., Applebury M. L., Coleman I. E., Wyckoff., Richards F. M. - J. Biol. chem. 1970. V. 245. P. 4975.
   8. Адунц Г. Т., Саркисян Л. В. - Биол. ж. Армении. 1975. T. 28. N9.