Reports-2004-Vol104-N3-Movsesyan

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 577.152.199:616.056

Н. О. Мовсесян¹, Н. Х. Алчуджян¹, Г. В. Элбакян²,
академик К. Г. Карагeзян²

Влияние N^a-пара-бутоксибензоил-L- аргинина на
продукцию оксида азота тромбоцитами и иммунокомпетентными
клетками крови

(Представлено 25/ХII 2003)

   Тромбоциты и иммунокомпетентные клетки крови (нейтрофильные гранулоциты, моноциты и лимфоциты) участвуют в воспалительной реакции с вовлечением синтазы оксида азота (КФ 1.14.13.39, NOS), продуцирующей из L-аргинина и некоторых аргинин содержащих пептидов оксид азота (NO) - важнейший регулятоp метаболизма клеток и физиологических функций организма в целом [1,2]. Генетически различающиеся три изоформы NOS проявляют различные каталитические свойства. В частности, для обеспечения активности нейронального, NOS-1, и эндотелиального, NOS-3, изоферментов необходимо присутствие ионов Са²⁺, обеспечивающих связывание одного из кофакторов NOS - кальмодулина (СаМ) с соответствующим доменом. Активность "индуцибельного" изофермента, NOS-2, благодаря прочной связи с СаМ в сравнительном аспекте не зависит от Са²⁺ [3]. Согласно современным представлениям NOS-2 - один из эффекторов клеточного иммунитета, активирующийся при хронических инфекциях, аутоиммунных болезнях, некоторых экстремальных состояниях организма, способный продуцировать NO в течение длительного времени (до нескольких дней), обеспечивая высокий уровень последнего [4]. При воспалениях NOS-2 выступает в роли регулятора активности лейкоцитов [2]. Последние, преодолевая гематоэнцефалический барьер, оказывают влияние на метаболические реакции в ЦНС с образованием цитокинов, напрямую связаных с индукцией NOS-2 в мозге [5]. В этой связи особый интерес представляет изучение в клетках крови метаболического пути L-аргинин-NO, а также возможностей его регулирования, что явилось предметом наших исследований.
   Были обследованы здоровые женщины (38-51 год, n = 3) и пациентки с диагнозом периодическая болезнь (ПБ) (16-60 лет, n = 4). Кровь из локтевой вены забирали утром натощак. Из крови выделяли тромбоциты, нейтрофилы, моноциты и лимфоциты [6]. Из полученных клеточных взвесей готовили суспензию в 20 мМ HEPES буфере (рН 7.05) и в аликвотах определяли активность NOS. Действие СН1 на активность NOS определяли in vitro введением препарата в реакционную смесь (5 мкмоль/мл). Реакцию NOS запускали добавлением испытуемых фракций в инкубационную смесь с конечным объемом 1.32 мл: 20 мМ HEPES (pH 7.05) (содержащий 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl₂,), 0.5 мM NADPH, 50 мкМ (6R)-5,6,7,8-тетрагидробиоптерина, 5 мкМ FAD, 5 мкМ FMN, 5 мM L-аргинина. В соответствии с требованиями эксперимента в пробы вносили СаМ (10 мкг/мл). Об активности NOS судили по количеству продуцируемых из L-аргинина за 24 ч инкубации нитрит/нитрат анионов (мкг/мл крови), определяемых реакцией диазотизации, спектрофотометрически при длине волны 546 нм [7].
   Согласно литературным источникам [8] основная a-аминогруппа L-аргинина участвует в обеспечении субстратной специфичности, в частности, стерического эффекта, необходимого для реакции NOS. Было изучено влияние вновь синтезированного нами аналога L-аргинина с замещённой a-аминогруппой - N^a-пара-бутоксибензоил-L-аргинина (препарат СН1) на продукцию биогенного NO в тромбоцитах, иммунокомпетентных клетках, а также в цельной крови для оценки совокупного действия изоферментов NOS всех форменных элементов (ФЭ). Литературные данные об активности NOS в клетках крови противоречивы, что, вероятно, обусловлено трудностями в определении NO вследствие его быстрого превращения в пероксинитрит (ONOO-), как это сообщалось относительно активированных липополисахаридом гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека [9,10], а также активного взаимодействия NO с железо- и гемсодержащими белками, сульфгидрильными группами различных соединений [1,2,11].
   Нам удалось выявить активность NOS в исследуемых ФЭ человека, поддерживая рН 7.05, при котором протонированная форма пероксинитрита неустойчива и распадается на ОН- и NO₂ - радикалы со скоростью 0.4±0.01 с^-1 [12]. Определение активности NOS-2 осуществляли на основе предварительной обработки ЭДТА, хотя и с потерями, поскольку для обеспечения оптимального связывания СаМ с NOS-2 человека также требуется небольшое количество кальция, а связывающий кальций ЭДТА, равно как трифторперазин - антагонист кальмодулина, снижаeт эту активность на 50-65% [13]. Активность всех изоформ NOS ФЭ оценивали введением СаМ в состав реакционной смеси.

Влияние in vitro N^a-пара-бутоксибензоил-L-аргинина (СН1) на синтез NO в форменных элементах и
цельной крови здоровых женщин и больных ПБ (FMF). По оси абсцисс: 1 - кровь; 2 - тромбоциты; 3 -
нейтрофилы; 4 - лимфоциты; 5 - моноциты. По оси ординат: нитрит/нитрат анионы (мкг/мл крови,
время инкубации - 24 ч). Представлены средние результаты опытов.

На рисунке представлены средние результаты анализа крови женщин: здоровых доноров и больных ПБ, или семейной средиземноморской лихорадкой (FMF), с аутосомно-рецессивным типом наследования, характерным для армянской популяции [14]. Не было обнаружено прямой корреляции между интенсивностью продукции NO исследуемыми ФЭ и таковой в цельной крови, что указывает на возможное взаимовлияние фракций, проявление активности эритроцитарной NOS, а также влияние соединений плазмы на активность NOS ФЭ [15]. В тромбоцитах помимо активности Ca²⁺/CaM-зависимой NOS-3 [1] была обнаружена Ca²⁺/CaM-независимая активность NOS, что, возможно, обусловлено проявлением активности митохондриальной изоформы фермента. У здоровых женщин во всех фракциях, кроме лимфоцитов, активность NOS в отсутствие СаМ в инкубационной среде превалировала над таковой при наличии СаМ. Возможно, в условиях долговременной инкубации клеток крови человека СаМ оказывает дестабилизирующее влияние на фермент и/или имеет место более активное метаболизирование NO. Апробированный нами препарат СН1 в отсутствие СаМ в инкубационной среде снижал у здоровых женщин интенсивность образования NO в лимфоцитах, моноцитах и в меньшей степени в тромбоцитах, одновременно повышая её в нейтрофилах и цельной крови. СаМ изменял влияние СН1 на активность NOS в лимфоцитах и моноцитах от ингибирования к стимулированию, а в цельной крови их совместное действие способствовало ещё большему повышению активности фермента. Инверсия действия СН1 на NOS в присутствии СаМ проявлялась в заметном снижении аргинин-зависимого синтеза NO нейтрофилами. По-видимому, NOS-2 и Ca²⁺/CaM-зависимые изоформы NOS отличаются по способности метаболизировать СН1, и полученные нами результаты отражают особенности изоферментного спектра NOS исследуемых клеток крови человека. На рисунке представлен биохимический паттерн активности NOS ФЭ крови больных ПБ. У пациенток с ПБ во всех исследуемых фракциях наблюдался пониженный уровень активности NOS по сравнению со здоровыми женщинами, что может быть обусловлено ретроингибированием фермента нитритами и/или цитруллином, содержание которых в плазме больных ПБ было повышено (данные не указаны). Интересно, что в нейтрофилах, играющих важную роль в развитии и течении воспалительной реакции при ПБ, наблюдалась самая низкая активность NOS. У больных была резко снижена и активность NOS тромбоцитов. Отметим, что NO активирует растворимую гуанилатциклазу и подавляет экспрессию Р-селектина, влияя на взаимодействие лейкоцитов и тромбоцитов и препятствуя их агрегации и адгезии в процессе воспалительной реакции [1,4]. У пациенток с ПБ во всех ФЭ, кроме лимфоцитов, активность NOS в присутствии СаМ была выше, чем без СаМ - картина, полностью противоположная таковой у здоровых доноров. Интересно, что у больных ПБ CH1 значительно повышал продукцию NO тромбоцитами и лимфоцитами, тогда как в отсутствие CaM он снижал активность NOS. И наоборот, в нейтрофилах и моноцитах стимулирование активности фермента препаратом СН1 наблюдалось лишь в присутствии СаМ (в 1.7 и 2.9 раза, соответственно).
Таким образом, нами обнаружены изменения в биохимическом паттерне активности NOS в тромбоцитах и иммунокомпетентных клетках крови человека при ПБ, подтвержденные селективным влиянием на активность изоформ NOS ФЭ нового N^a-производного L-аргинина в норме и при ПБ.
Авторы выражают благодарность С. А. Казаряну за любезно предоставленный препарат N^a-пара-бутоксибензоил-L- аргинина.

Институт биохимии им Г. Х. Бунятяна НАН РА
Институт милекулярной биологии НАН РА

Литература

   1. Серая И. П., Нарциссов Я. Р. - Успехи совр.биол. 2002. Т.122. N3 С. 249-258.
   2. Hickey M. J. - Clin. Science. 2000. V. 100. №1. P. 1-12.
   3. Alderton W. K., Cooper C. E., Knowles R. G. - Biochem J. 2001. V. 357. № 3. P. 593-615.
   4. Esh T., Stefano G. B., Fricchione G. L., Benson H. - Med. Sci. Monit. 2002. V. 8. № 6. P. 103-118.
   5. Licinio J., Prolo P., McCann S. M., Wong M. - Mol.Med. 1999. V. № 5. P. 225-232.
   6. Фрик Г., Прейснер З. С., Иенсен Г. Л., Бурмейстер Ю. В кн.: Иммунологические методы (под ред. Х.Фримеля). М. Мир. 1979. c. 518.
   7. Tracey W. R., Linden J., Peach M. J., Johns R. A. - J. Farm. Exp.Ther. 1989. V. 252. № 3. P. 922-928.
   8. Hrabak A., Bajor T., Temesi A. - Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 198. №1. P. 206-212.
   9. McBride A., Brown G. C. - FEBS Lett. 1997. V. 417. № 2. Р. 231-234.
   10. Gagnon C., Leblond F. A., Filep J. G. - FEBS Lett. 1998. V. 431. № 1. P. 107-110.
   11. Проскуряков С. Я., Бикетов С. И., Иванников А. И., Скворцов В. Г. - Иммунология. 2000. Т. 4. № 1. С. 9-20.
   12. Pryor W. A., Gueto R., Jin X., Koppenol W. H., Uppu R. M. - Free Radl.Med. 1995. V.18. P. 75-83.
   13. Geller D. A., Lowenstein C. J., Shapiro R. A., Nussler A. K., DiSilvio M., Wang S. C., Nakayama D. K., Simmons R. L., Snyder S. H., Billiar T. R. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P. 3491-3495.
   14. Оганесян З. Р., Айрапетян А. С., Шахсуварян Г. Р., Атаян К. Е., Саркисян Т. Ф. - Мед. наука Армении. 2002. T. 42. № 2. С. 47-52.
   15. Vallance P. - Nitric Oxide (R.J. Gryglewski, P. Minuz, Eds.) IOS Press. 2001. V. 317. P. 53-56