БИОХИМИЯ

УДК 616.36.004.612.1.599.322

А. С. Маргарян, А. А. Симонян, М. А. Симонян, академик А. А. Аветисян

Изменение эндогенных уровней металлопротеинов крови и печени
крыс при CCl4-индуцированном циррозе печени и антистрессорный
эффект a-токоферола

(Представлено 21/XI 2003)

   При циррозе печени наблюдается изменение активности окислительно-восстановительных ферментов аэробного метаболизма в крови и печени [1-5]. Повышение уровня липидной пероксидации в печени при циррозе дает основание использовать антиоксидантные системы, ингибиторы этой пероксидации, в частности a-токоферол, как эффективные антистрессорные факторы [6 - 8].
   Целью работы является определение при CCl4-индуцированном циррозе эндогенных уровней металлопротеинов крови и печени крыс - регуляторов метаболизма активных форм кислорода (АФК), а также липидной пероксидации в печеночной ткани под воздействием a-токоферола в лечебном режиме.
   Белые половозрелые крысы (180-200 г) обоих полов были разделены на три группы (по 14 животных): контрольную (К) и две опытные (ОГ-1 и ОГ-2). Контрольные животные получали внутрибрюшинно физиологический раствор (по 1 мл) на I, IV и VII день опыта. Животные ОГ-1 получали по 1.5 мл/кг CCl4 также на I, IV и VII день опыта. Животные ОГ-2 получали аналогичным образом CCl4, затем 2 мг/кг (по 1 мл) a-токоферола на IV, VII и XV день опыта. Животные были декапитированы под легким эфирным наркозом через 30 дней. Кровь животных стабилизировали 2% оксалатом натрия в объемном соотношении 10:1. Одновременно у них была взята печень.
   Металлопротеины анти- и прооксидантного действия получали из крови ранее разработанным способом [9]. Кровь подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах DE-52, KM-52, сефадексе DEAE A-50 и гель-фильтрации на биогеле P-100, белковые фракции гемолизата сыворотки и мембран эритроцитов, с элюированием металлопротеинов калий-фосфорным буфером (КФБ) при pH 7.4 с различной молярностью, отдиализовывали против воды. Металлопротеины печеночной ткани получали биотехнологическим способом [10], с некоторым видоизменением для получения суммарной фракции Cu, Zn-СОД, Mn-СОД, каталазы и цитохрома С.
   После гомогенизации печеночной ткани в 0.04 М КФБ смесь замораживали при 100 в течение ночи, затем размораживали и супернатант собирали центрифугированием гомогената при pH 5.6. После диализа и центрифугирования супернатант подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе KM-52 ("Whatman", Англия). Затем колонку промывали 0.01 М КФБ и элюировали цитохром С 0.2 М КФБ. Не осевшие на колонке белки являются суммарной фракцией Cu, Zn-СОД, Mn-СОД и каталазы. Количество продукта аскорбатзависимой липидной пероксидации - малонового диальдегида (МДА) определяли методом Владимирова и сотр.[11], выражая его в нмолях на 1 г ткани (для МДА при 536 нм, с j = 1.56·105 M-1 см-1). Супероксиддисмутазную активность фракций определяли по нитротетразолиевому синему (НТС) тесту, путем нахождения величины плотности максимального оптического поглощения формазана (при 560 нм), образовавшегося после восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД-активности принимали количество фракций, вызывающее 50%-ное ингибирование образования формазана. Удельная активность СОД была определена в расчете на 1 мл эритроцитов или 1 г печеночной ткани.
   O-2-продуцирующую активность супрола и цитохрома b-558 III также определяли НТС тестом, путем вычисления прироста плотности максимального оптического поглощения формазана (при 560 нм) под воздействием определенных количеств O-2-продуцирующих белков. За единицу O-2-продуцирующей активности принимали количество белков, вызывающее 50%-ное повышение величины плотности оптического поглощения формазана. Удельная O-2-продуцирующая активность супрола и цитохрома b-558 III была определена в расчете на 1 мл сыворотки или 1 мл эритроцитов соответственно.
   Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим методом, путем вычисления количества расщепленной H2O2 определенным количеством фермента при 200 в течение 1 мин. За единицу каталазной активности принимали количество фермента, расщепляющее 0.1 М H2O2 в описанных условиях. Удельную каталазную активность определяли в расчете на 1 мл эритроцитов или 1 г печеночной ткани. Количество металлопротеинов антиоксидантного действия (МАД) (Cu, Zn-СОД и каталазы, полученные из растворимой фракции эритроцитов, церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) - из сыворотки крови) и металлопротеинов прооксидантного действия (МПД) (цитохромы: b5 - из растворимой фракции эритроцитов, b-558 I и b-558 II - из сыворотки крови, b-558 III и b-558 IV - из мембран эритроцитов; супероксидпродуцирующий липопротеин сыворотки - супрол) определяли путем вычисления величины плотности характерного для данного белка максимального оптического поглощения (в нм): для цитохрома С при 520 (окисленная форма), цитохрома b5 - 525, цитохромов b-558 - 530 (b-полоса), ЦП - 610, ТФ - 470 и супрола - 420-430 (слабое поглощение). Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента - Фишера.

Таблица 1

Относительные изменения металлопротеинов крови и печени (%) при
CCl4-индуцированном циррозе печени (ОГ-1) и под воздействием a-токоферола
(ОГ-2) по сравнению с контрольными показателями, которые принимаются за
100% (P < 0.05; n=6)

       Металлопротеины   Цирроз (ОГ-1), % Цирроз + витамин Е (ОГ-2), %
Кровь
Цитохром b5        -6.3±0.2        +87.0±5.9
S Цитохром b-558 I+II        -45.5±3.3        -18.9±2.0
S Цитохром b-558 (до хромотографии)        +10.0±1.0        +16.6±2.1
Цитохром b-558 III        -9.7±0.4        -16.1±1.9
Цитохром b-558 IV        -14.0±1.2        +4.0±0.7
Нейтральный цитохром b-558        -42.2±3.6        -57.9±4.0
Супрол        -50.0±3.9        +17.6±2.3
O2--продуцирующая активность супрола        +28.7±2.4        -9.6±1.1
O2--продуцирующая активность цитохром b-558 III        +11.8±1.0        +18.4±1.4
ЦП        +66.7±3.4        +33.4±2.4
ТФ        -53.4±2.9        +86.1±4.0
СОД        -12.6±1.8        +26.0±2.1
Каталаза        -24.0±2.1        +117.0±6.8
Печень
Каталаза        -56.2±4.1        -40.0±4.3
S Cu, Zn-СОД и Mn-СОД        +47.0±3.4        +42.7±3.1
Цитохром C        -90.6±6.8        -61.2±3.9
МДА        +41.3±3.3        +26.4±3.9

     Печеночная ткань у животных ОГ-1 под воздействием CCl4 подвергалась характерным для цирроза изменениям: прогрессирующему фиброзу, некрозу и структурным изменениям, что привело к частичной гибели животных (24-25%). В ОГ-1 наблюдались и ощутимые смещения по сравнению с нормой эндогенных уровней металлопротеинов эритроцитов и сыворотки (табл. 1). На фоне ощутимого снижения уровня сывороточных цитохромов b-558 I, b-558 II, нейтрального характера цирохрома b-558 [12], супрола, ТФ, СОД и каталазы наблюдалось небольшое увеличение суммарного уровня эритроцитарных мембранных цитохромов b-558 (до проведения ионообменной хроматографии) и заметное увеличение уровня ЦП. Фактически снижение ТФ компенсируется повышением уровня ЦП. Увеличение уровня ЦП (как белка острой фазы [13]) скорее всего связано с повышением восстановительных процессов в печеночной ткани в ОГ-1.

Таблица 2

Относительные изменения АС и ПС (%) в крови и печени при
CCl4-индуцированном циррозе печени (ОГ-1) и под воздействием a-токоферола
(ОГ-2) по сравнению с контрольными показателями, которые принимаются за
100% (P < 0.05; n=6)

Компоненты крови Цирроз (ОГ-1) Цирроз+витамин Е (ОГ-2)
и печени АС ПС АС ПС
Сыворотка +23.3±2.2 -68.8±4.9 +119.4±8.1 -10.9±1.2
Эритроциты -36.6±3.1 +15.6±1.3 +143.0±10.4 +122.0±10.1
Печень -9.2±0.3 -49.3±3.6 2.7±0.2 -35.8±3.0

     В ОГ-1 наблюдаются интенсивные явления, связанные с характерным изменением соотношений между цитохромами b-558 III (гемопротеин кислого характера) и b'-558 III (гемопротеин сильнокислого характера). Примерно 87% цитохрома b-558 III превращается в цитохром b'-558 III в результате цирроза печени. Цитохром b'-558 III практически не растворяется в КФБ при pH 7.4 в отличие от цитохрома b-558 III. Как результат этого цитохром b'-558 III переходит в осадок и растворяется только при pH > 9. Таким образом, при CCl4-продуцированнoм циррозе печени наблюдаются изменения в составе эритроцитарных мембран. Это может быть использовано как новый патологический механизм цирроза и как механизм оксидативного повреждения эритроцитарных мембран при циррозе. Такое явление имеет место и при некоторых разновидностях злокачественного опухолеобразования [12, 14].
   В печеночной ткани снижение каталазной активности компенсируется повышением СОД-активности (ОГ-1). Резкое снижение уровня цитохрома С свидетельствует о заметном снижении дыхательных метаболических процессов, связанных с переносом электрона в митохондриях печени. С другой стороны, снижение уровня каталазы может вызывать стимулирование липидной пероксидации перекисью водорода [15, 16]. При CCl4-продуцированном циррозе печени в сыворотке крови антиоксидантный статус (АС - суммарный расчетный уровень антиоксидантных металлопротеинов) намного больше прооксидантного статуса (ПС - суммарный расчетный уровень факторов прооксидантного действия - металлопротеинов), в отличие от эритроцитов, где АС снижен больше, чем ПС (табл. 2). В печени же ПС снижен намного больше, чем АС (за счет цитохрома С).
   В ОГ-2 благодаря введению a-токоферола гибели животных не наблюдается. Не имеет места и процесс окисления цитохрома b-558 III в цитохром b'-558 III и даже наблюдается приближение к норме уровней металлопротеинов крови и печени. Интересно, что в эритроцитах животных ОГ-2 резко увеличивается активность каталазы. Хотя в ОГ-2 наблюдается 29-30%-ное увеличение уровня цитохрома С, однако он остается еще заметно пониженным, низким остается также уровень каталазы в печени (табл. 1).
   Как видно из табл. 2, АС в сыворотке крови, эритроцитах и печени намного больше ПС, однако еще не происходит полной нормализации АС и ПС. Эти результаты хорошо корректируются с имеющимися литературными данными [6-8]. Таким образом, при экспериментальном CCl4-индуцированном циррозе печени наблюдается существенное нарушение баланса между АС и ПС в крови и печени, а a-токоферол в большинстве случаев играет положительную антистрессорную роль.

     Институт биохимии им. Г. Х. Бунятяна НАН РА

 Литература

     1. Gonzalez-Reimers E., Lopez-Lirola A., Olivera R. M. et.al.  - Biol. Trace. Elem. Res. 2003. V. 93. P. 127-140.
     2. Cabre M., Camps J., Ferre N. et. аl.  - Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2001. V. 71. P. 229-236.
     3. Irshad M., Chaudhuri P. S., Joshi Y. K.  - Hepatol. Res. 2002. V. 23. P. 178-184.
     4. Koruk M., Aksoy H., Akcay F.,Onuk M. D.  - Ann. Clin. Lab. Sci. 2002. V. 32. P. 252-256.
     5. Tanaka A., Morimoto T., Wakashiro S. et. al.  - Life Sci. 1987. V. 41. P. 741-748.
     6. Fields M., Lewis C. G.  - Ann. Clin. Biochem. 1997. V. 13. P. 656-663.
     7. Sakuma N., Noguchi Y., Hibino T.  - Nippon Ronen Igakka, Zasshi. 1997. V. 34. P. 729-732.
     8. Noguchi N., Gotoh N., Niki E.  - Biofactors. 1998. V. 7. P. 41-50.
     9. Симонян М. А., Симонян Г. М.  Способ получения металлопротеинов крови. Ереван. 1997. Армпатент. Лицензия изобретения N 341.
     10. Симонян М. А.  Способ получения супероксиддисмутазы из животного сырья. Открытия, изобретения. 1988. N 28. С. 107.
     11. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И.  Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Наука. М. 1972. 252 с.
     12. Симонян Г. М.  Оксидативный стресс при злокачественных новообразованиях. Автореф. канд. дис. Институт биохимии. 2003.
     13. Мжельская Т. И.  - Бюлл. эксп. биол. и мед. 2000. N130. С. 124-132.
     14. Симонян Г. М.,Симонян Р. М., Бабаян М. А., Нерсесян А. К., Симонян М. А.  - Мед. наука Армении. 2003. Т. 43. N 2. С. 31-34.
     15. Afanasev I.B., Dorozhk A. I.  - Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 302. P. 200-227.
     16. Toren F.  - Current Opinion in call biol. 1998. V. 10. P. 248-253.