УДК 577.112.546.616

   Интоксикация (острая и хроническая) крыс ионами тяжелых металлов вызывает нарушение антиоксидантного и прооксидантного статуса в крови и других тканях, приводя к оксидативному стрессу. Происходят сдвиги эндогенных уровней металлопротеинов антиоксидантного и прооксидантного действия - регуляторов метаболизма активных форм кислорода (АФК) [1-5]. Для снижения губительных эффектов интоксикации тяжелыми металлами часто используются низкомолекулярные соединения экстрактов растений [6], нордигидрогуаировая кислота [7], витамин Е, аскорбиновая кислота и др. [8]. Эти вещества, в основном, снижают уровень АФК при интоксикации ионами тяжелых металлов, оказывая антистрессорный эффект. Антистрессорный эффект оказывает и пролин-богатый пептид (ПБП) галармин [9-12]. Открытие нейрострессорных цитокинов мозга, в частности пролин-богатых полипептидов, продуцируемых клетками N.Paraventricularis и N.Supraoptorus гипоталамуса [13], стало важным этапом в изучении биохимических механизмов действия этих нейропептидов-цитокинов как на иммунную систему, так и на многие окислительно-восстановительные метаболические процессы при различных проявлениях оксидативного стресса (отравление змеиным ядом [14], сердечно-легочная недостаточность [12]). Было установлено, что при явно выраженных нейродегенеративных поражениях нервных клеток мозга крыс (гиппокампа) под влиянием AlCl₃ ПБП не только восстанавливает выживаемость животных, но и способствует выводу Al из организма [11]. Эти данные послужили основанием для предположения о положительном воздействии галармина при отравлении тяжелыми металлами.

Относительные изменения (%) эндогенных уровней МАД и МПД и их активностей при ОИТМ под воздействием галармина (n=4, P < 0.05)

 
   Целью работы является комплексное определение количественных и качественных изменений ключевых металлопротеинов антиоксидантного и прооксидантного действия в крови крыс при острой интоксикации ионами тяжелых металлов (ОИТМ) (Fe⁺³, Cu⁺², Pb⁺² и Hg⁺²) под воздействием галармина в лечебном режиме.
   Белые крысы-самцы массой 160-180 г, содержащиеся на полноценном рационе в течение 30 дней до начала эксперимента, были разделены на 8 групп (по 7 крыс в каждой). Животные 1 опытной группы (ОГ-1) получали внутрибрюшинно Fe⁺³ в виде раствора FeCl₃ по 50 мг/кг веса животного. Животным ОГ-1' в первый и второй день после введения Fe⁺³ вводился также внутрибрюшинно галармин по 120 мкг/кг веса животного. Аналогичным образом животные ОГ-2 получали по 150 мг/кг Cu⁺² в виде раствора CuSO₄, а животные ОГ-2` наряду с Cu<sup>+2</sup> получали и галармин. Животные ОГ-3 получали Pb<sup>+2</sup> в виде подкисленного ацетата свинца по 100 мг/кг. Животные ОГ-3' наряду с Pb<sup>+2</sup> получали и галармин. Животные ОГ-4 получали Hg<sup>+2</sup> в виде раствора HgNO<sub>3</sub> (20 мг/кг). Животные ОГ-4` наряду с Hg⁺² получали и галармин. Контрольным животным вводился физраствор в аналогичных условиях.
   Кровь животных в каждой группе стабилизировали 2% оксалатом натрия. Металлопротеины крови прооксидантного действия (МПД) (цитохром b₅ из растворимой фракции эритроцитов; суммарная фракция цитохромов b₅₅₈I и b₅₅₈II из сыворотки крови, суммарная фракция цитохромов b₅₅₈III и b₅₅₈IV из мембран эритроцитов; супероксидпродуцирующий липопротеин - супрол из сыворотки крови) и антиоксидантного действия (МАД) (Cu,Zn-СОД и каталаза из растворимой фракции эритроцитов; церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) из сыворотки крови) одновременно были выделены и очищены по разработанному нами способу без использования детергентов [15] для солюбилизации эритроцитарных мембранных гемопротеинов, так как детергент ощутимо снижает стабильность цитохромов b₅₅₈ . Отдиализованные белковые фракции сыворотки, эритроцитарных мембран и растворимой фракции эритроцитов подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозах DE-52 и KM-52 ("Whatman", Англия), сефадексе DEAE A-50 ("Pharmacia", Швеция) с последующей гель-фильтрацией на биогеле P-100 ("Reanal", Венгрия). Количество полученных металлопротеинов определяли по величинам плотностей максимальных оптических поглощений, характерных: для цитохромов b₅₅₈ при 530 нм, цитохрома b₅ - 525 нм, супрола - 430 нм (или 280 нм), ЦП - 610 нм и ТФ - 470 нм. Супероксиддисмутазную активность фракций, супероксидпродуцирующую активность супрола и НADPH-зависимую супероксидпродуцирующую активность цитохрома b₅₅₈III определяли методом нитротетразолиевого синего (НТС), рассчитав процент ингибирования или прироста образования формазана (при 560 нм) при восстановлении НТС супероксидными радикалами в присутствии СОД, супрола и цитохрома b₅₅₈III соответственно. За единицу СОД-активности принимали количество фракции, способное ингибировать образование формазана на 50%. За единицу O₂^- -продуцируюшей активности супрола или цитохрома b₅₅₈III принималось количество фракции, стимулировавшее образование формазана на 50%. Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим методом, рассчитав количество расщепленной H₂O₂ (М). За единицу каталазной активности принимали количество фракции, расщеплявшее 0.1 М H₂O₂ за 1 мин при 20^o. Удельные активности приведенных метаболитов определяли в рассчете на 1 мл эритроцитов (для Cu,Zn-СОД, каталазы и цитохрома b₅₅₈III ) и на 1 мл сыворотки (для супрола).
   Оптические спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Specord UV-VIS" (Германия) с длиной оптического пути 1 см. В ходе получения и очистки металлопротеинов были использованы также центрифуги К-24 и К-70 (Германия) и стеклянные колонки с фильтрами различных размеров (2×20, 4×30, 2×80 см). Для проверки воспроизводимости полученных результатов опыт повторяли четыре раза. Статистическую обработку осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента - Фишера.
   Обобщенная картина относительных изменений (%) эндогенных уровней металлопротеинов крови - регуляторов метаболизма АФК (по сравнению с контрольными показателями, которые принимаются за 100%) после острой интоксикации ионами тяжелых металлов (Fe⁺³, Cu⁺², Pb⁺² и Hg⁺²) представлена в таблице. Очевидно, что эти изменения в основном происходят по-разному. ОИТМ вызывает ощутимое отклонение от нормы эндогенных уровней МПД и МАД, создавая условия соответственного оксидативного повреждения компонентов крови. Уровень цитохрома b₅ во всех группах повышался, что может являться результатом ограниченной подвижности (это неоднократно было показано при гипокинезии крыс, когда уровень цитохрома b₅ повышался в 3-4 раза). Уровень сывороточных цитохромов b₅₅₈ повышался в ОГ-1, ОГ-1`, ОГ-3, а в остальных группах не изменялся или даже снижался (ОГ-4 и ОГ-4`). В ОГ-1 организм оказался в силах создавать соответственное повышение уровня сывороточных цитохромов b₅₅₈, способных защитить биосистемы сыворотки от губительного воздействия H₂O₂. Таким образом несколько компенсируется снижение уровня каталазы в эритроцитах в ОГ-1. В действительности, в тех группах, где повышен уровнь цитохромов b₅₅₈I и b₅₅₈II, снижен уровень каталазы, и наоборот (в ОГ-2, ОГ-4). Исключение составляет ОГ-3. Вторая закономерность - повышение при интоксикации уровня эритроцитарных мембранных цитохромов b₅₅₈ в исследуемых группах независимо от металла. Более того, рост уровня цитохромов b₅₅₈III и b₅₅₈IV сопровождается повышением НADPH-зависимой O₂^- -продуцирующей активности цитохрома b₅₅₈III как нового структурно-функционального компонента мембран эритроцитов. Данный факт свидетельствует о том, что эритроцитарные мембраны претерпевают ощутимые изменения, скорее всего, из-за повышения липидной пероксидации фосфолипидных остатков мембран эритроцитов [12] и этот процесс может инициироваться продуцируемыми цитохромом b₅₅₈III супероксидными радикалами и H₂O₂ [16]. Фактически цитохром b₅₅₈III мембран эритроцитов претерпевает не только количественные, но и качественные изменения. Супрол также претерпевает количественные и качественные изменения. Повышение его уровня в основном сопровождается снижением O₂^- -продуцируюшей активности, что связано с усилением расходования супрола путем перекисного окисления фосфолипидных остатков, в ходе которого происходит его самоактивирование in vivo [17]. Уровень ЦП повышается в ОГ-1, ОГ-2, ОГ-3 и снижается в ОГ-4. Это свидетельствует о том, что при интоксикации ионами ртути организм все же не в силах повысить уровень белка острой фазы - ЦП. Это может быть причиной рокового исхода (в ОГ-4 имела место гибель двух животных). ТФ изменяется почти аналогично ЦП. Уровень Cu,Zn-СОД в эритроцитах практически не изменяется при ОИТМ, за исключением ОГ-4, где наблюдается некоторый рост уровня этого ключевого фермента антиоксидантного действия. Галармин не вызывает изменения уровня цитохрома b₅, однако приближает к норме уровни цитохромов b₅₅₈ сыворотки крови, за исключением показателей ОГ-1'. Галармин эффективно действует на эритроцитарные мембраны, приближая уровни цитохромов b₅₅₈ к норме во всех группах, и одновременно снижает O₂^- -продуцирущую активность цитохромов b₅₅₈ эритроцитарных мембран, приближая к норме и уровень каталазы. Однако под влиянием галармина ощутимых изменений уровня O₂^- -продуцирущей активности супрола не происходит. Уровень же ЦП имеет тенденцию к нормализации под воздействием галармина во всех группах. Это немаловажный фактор защиты биосистем галармином. Если уровень СОД практически не изменяется под воздействием галармина, то уровень каталазы, как уже отмечалось, ощутимо приближается к норме почти во всех группах (хотя в ОГ-4` уровень каталазы остается еще заметно выше по сравнению с нормой).
   Таким образом, галармин способствует стабилизации эритроцитарных мембран, регулируя уровень цитохромов b₅₅₈ и каталазы, и оказывает некоторый регулирующий эффект на сывороточные цитохромы b₅₅₈ и ЦП. Этим галармин "смягчает" оксидативное повреждение крови при ОИТМ, не обладая антиоксидантным воздействием in vitro. Молекулярные механизмы такого воздействия, видимо, связаны с его иммуномодуляторным антистрессорным воздействием.
   Галармин в описанном режиме не устраняет полностью факторы оксидативного стресса. Возможно, его использование при ОИТМ в других режимах окажется более эффективным.