БИОХИМИЯ

УДК 616.631.11.547.96

А.Р.Варданян

Влияние аллоксана на физико-химические свойства
металлопротеинов крови in vitro

(Представлено академиком А.А. Галояном 13/III 2002)

   Аллоксан в соответствующих дозах вызывает гибель инсулинпродуцирующих b-клеток в островке поджелудочной железы in vivo, что связывается с продуцированием во внеклеточной среде и непосредственно в b-клетках супероксидных радикалов (O2-) [1, 2]. Это подтверждает и воздействие профилактически введенной Cu, Zn-супероксиддисмутазы (СОД) при аллоксаниндуцированном диабете [3, 4]. Согласно свободнорадикальной теории диабетогенеза в островке b-клеток поджелудочной железы аллоксан восстанавливается до диалуриновой кислоты, и после его автоокисления образуются O2- и перекись водорода (как продукт ферментативного дисмутирования O2-) [5]. Образующаяся H2O2 по реакциям Габера-Вейса (Fe+3+O2- ® Fe+2+O2) и Фентона (H2O2+Fe+2 ® HO·+HO-+Fe+3) является источником высокотоксичных для различных биосистем гидроксильных радикалов (HO·). В частности, HO· нарушает синтез инсулина [6], выброс инсулина [7], метаболизм глюкозы и потребление кислорода [8]. Целью работы является определение факторов непосредственного воздействия аллоксана на физико-химические свойства ключевых металлопротеинов - регуляторов метаболизма активных форм кислорода крови in vitro, что позволяет расширить наши знания о молекулярных механизмах воздействия аллоксана in vivo.
   Металлопротеины крови антиоксидантного действия: Cu,Zn-СОД, каталаза - из растворимой фракции эритроцитов, церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) - из сыворотки крови и прооксидантного действия: цитохромы b558I и b558II, супероксидпродуцирующий липопротеин - супрол из сыворотки крови и цитохромы b558III и b558IV - из мембран эритроцитов выделяли и очищали методом М.А.Симоняна и сотр. [9] с определенными изменениями, в целях исключения использования детергента как солюбилизирующего агента эритроцитарных мембранных белков [10]. В частности, отдиализованные белковые фракции сыворотки, эритроцитарных мембран и плазматической части эритроцитов подвергали ионообменной хроматографии на отдельных колонках с целлюлозой DE-52 и KM-52 ("Whatman", Англия) и сефадексом DEAE A-50 ("Pharmacia", Швеция) с дальнейшим концентрированием на специальных фильтрах. В результате такой очистки получали электрофоретически гомогенные и лиофилизованные препараты указанных металлопротеинов. В опытах был использован препарат аллоксана фирмы "Sigma". Количество полученных металлопротеинов определяли по величине плотностей максимальных оптических поглощений, характерных для цитохромов b558I-IV при 530 нм (a-полоса в окисленном состоянии гемопротеинов), супрола - 430 нм (слабое поглощение), ЦП - 610 нм, ТФ - 470 нм. Супероксиддисмутазную активность фракций и супероксидпродуцирующую активность супрола определяли методом нитротетразолиевого синего [11], рассчитав проценты ингибирования или прироста образования формазана (при 560 нм) при восстановлении нитротетразолиевого синего супероксидными радикалами в присутствии СОД или супрола соответственно.


Рис.1. Интенсивность плотности максимального оптического поглощения
формазана (560 нм) под воздействием аллоксана. Формазан образуется при
восстановлении нитротетразолиевого синего супероксидными радикалами,
генерированными супролом (10-3 М) в присутствии аллоксана (время
инкубирования 60 мин при 20o, рH раствора 9.0).

Каталазную активность фракций устанавливли перманганатометрическим методом, рассчитав количество расщепленной H2O2 (М) определенным количеством фермента за 1 мин при 20o. Оптические спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре "Specord UV-VIS" (Германия) с длиной оптического пути 1 см. Опыт повторяли 4 раза для проверки воспроизводимости полученных результатов и для их статистической обработки методом Стьюдента - Фишера.

 

Рис.2. Воздействие аллоксана (2×10-2 М) на интенсивность плотности поглощения
ЦП (при 610 нм) при 20o (рH раствора 7.4): а - оптические спектры ЦП в отсутствии
аллоксана (1), после инкубирования в течение 2.5 ч (2). После аэрации или удаления
аллоксана происходит реокисление меди в активном центре ЦП с соответственным
повышением интенсивности плотности оптического поглощения при 610 нм (3); б -
кинетическая кривая падения интенсивности поглощения ЦП (при 610 нм) под
воздействием 2×10-2 М аллоксана (рH раствора 7.4).

   Аллоксан повреждает инсулинпродуцирующие b-клетки in vivo в островке поджелудочной железы в концентрациях 50-70 мг/кг веса животного, что для одной половозрелой крысы (массой 100 г) составляет около 2×10-2 М [3]. Поэтому для опытов in vitro был использован аллоксан, концентрация которого в реакционной смеси составляла 2×10-2 М. Во избежание изменения рH раствора в присутствии аллоксана (аллоксан имеет слабокислый характер) белки были растворены в 0,8М калий-фосфатном буфере (рH 7,4), буферная емкость которого практически не вызывала изменения рH раствора. Аллоксан (5×10-3 М) вызывал подавление на 50% супероксидпродуцирующей активности супрола, полученного из сыворотки плацентарной крови человека (рис.1). Полная инактивация этого супероксидпродуцирующего липопротеина нового типа происходила под воздействием 3×10-2 М аллоксана, после инкубирования аллоксана с супролом (10-3 М) в течение 60-70 мин при 20o. Такой дезактивирующий эффект аллоксана может быть связан с окислением NADPH группы супрола в аэробных условиях [12]. Видимо этот механизм реализуется и in vivo при аллоксановом диабете, при котором наблюдается падение O2--продуцирующей активности супрола с соответственным повышением его эндогенного уровня (это может быть связано с подавлением процесса расщепления супрола путем липидной пероксидации супероксидными радикалами). Под воздействием аллоксана (2×10-2 М) при 20o в течение часа происходит почти полное восстановление Cu(II) до Cu(I) в активном центре ЦП, что обусловливается прямолинейным падением интенсивности плотности характерного максимального оптического поглощения при 610 нм нативного ЦП (рис. 2 а, б). Это восстановление в 70±7,1% (P < 0,05) имеет обратимый характер (после аэрации кислородом или удаления аллоксана 30,2±4,1% (P < 0,01) ЦП остается в восстановленном состоянии и теряет свою нативность (рис.2, а, 3). В результате этого около 30% ЦП теряет свою ферроксидазную активность. Такой эффект наблюдается в опытах in vivo при аллоксановом диабете [13, 14].

 

Рис. 3. Изменение максимума оптического поглощения ТФ под воздействием
2×10-2 М аллоксана, время инкубирования 3 ч при 20o и рH 7.4: а - оптический
спектр поглощения нативного ТФ (1) и после воздействия аллоксана (2); б -
кинетическая кривая изменения максимального поглощения под воздействием
аллоксана в приведенных условиях.

   Аллоксан приводит к смещению характерного максимального оптического поглощения ТФ от 470 нм к 485 нм (рис. 3), не изменяя плотности поглощения in vitro в течение 3 ч при 20o. Это явление носит необратимый характер и, видимо, действует на процесс связывания ионов Fe(II), наблюдаемый при аллоксановом диабете [15]. Аллоксан подавляет H2O2 расщепляющую активность каталазы на 20,2±3,3% (P < 0,05) в течение часа и практически не дезактивирует Cu,Zn-СОД при 20o, что свидетельствует о связи токсического влияния аллоксана с образованием и действием супероксидных радикалов. Аллоксан в приведенных условиях практически не вызывает каких-либо изменений форм и характерных максимумов поглощений оптических спектров как сывороточных (цитохромы b558I и b558II), так и мембранных эритроцитарных цитохромов b558III и b558IV [9]. Возможно эти гемопротеины новых типов приспособлены к воздействиям O2-, более того, они являются, в основном, NADPH-зависимыми O2--продуцирующими системами.
   Однако в экспериментах in vivo аллоксановый диабет в основном, обостряется в течение не 2-3 ч, а 7-10 суток. За это время защитно-адаптационные механизмы организма вырабатывают соответственный уровень супрола, ЦП, ТФ и каталазы, несколько увеличивая их. Это компенсирует понижение ферроксидазной активности ЦП, Fe-связывающей активности ТФ [13] и активности каталазы. Cu,Zn-СОД активность в крови при аллоксановом диабете снижается in vivo и не изменяется под воздействием аллоксана in vitro, что свидетельствует о повышенном расходовании СОД в процессе дисмутирования повышенных концентраций супероксидных радикалов. Напомним, что O2-, наряду с H2O2 (последние являются продуктом ферментативного дисмутирования O2-), способны инактивировать Cu,Zn-СOД [16]. Можно констатировать, что механизмы воздействия аллоксана in vivo и in vitro несколько совпадают и связаны не только с нарушением функции инсулининдуцирующих b-клеток островков поджелудочной железы in vivo, но и с непосредственным нарушением функций некоторых ключевых металлопротеинов (супрол, ЦП, ТФ, каталаза) в эксперименте.

    Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА
    Медицинский колледж им М.Гераци, Гюмри

 

Литература

     1. Grankvist K., Marklund S.  - FEBS Lett. 1979. V.105. P. 15-18.
     2. Fischer L.J.  - Diabetes. 1980. V. 29. P. 213-216.
     3. Grankvist K., Marklund S.  - Nature. 1981. V. 294. P. 158-160.
     4. Симонян М.А., Геворкян Д.М., Мхитарян В.Г.  - Бюлл. эксп. биол. мед. 1987. Т. СIII. С. 306-308.
     5. Heikkila R.E., Winston B., Cohen G., Barden H.  - Biochem. Pharmac. 1976. V. 25. P. 1085-1092.
     6. Gunnarsson R.  - Molec. Pharmac. 1975. V. 11. P. 759-765.
     7. Lacy P.E., Lernmark A., Sehlin J., Taljedal I.B.  - Biochem.J. 1977. V. 162. P. 9-18.
     8. Borg H., Eide S.J., Anderson A., Hellerstrom C.  - Biochem.J. 1979. V. 182. P. 797-802.
     9. Симонян М.А., Симонян Г.М., Мелконян Р.В.  - Пром. собств. (Офиц. бюлл. Армпатента). Ереван. 1997. С.34.
     10. Симонян М.А., Симонян Г.М., Григорян Г.Г., Симонян Р.М.  - Лицензия изобр. N 908. Армпатент. 2001. Ереван.
     11. Nishikimi M., Rao N.A., Jagik K.  - Biochem. Biophys. Res. Comm. 1972. V. 46. P. 849-856.
     12. Симонян М.А., Карапетян А.В., Бабаян М.А., Симонян Р.М.  - Биохимия. 1996. Т.61. С.932-937.
     13. Варданян А.Р., Геворкян Д.М., Агаджанов М.И., Симонян М.А.  - Мед. наука Армении. 1999. Т. 39. С.38-42.
     14. Мжельская Т.И.  - Бюлл. эксп. биол. мед. 2000. Т.130. С.124-133.
     15. Fujii H., Johonson M.K., Finnegan M.G. et.al.  - J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 12685-12694.
     16. Fridovich I.  - Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 64. P. 97-112.