УДК 547.963.3:616-0:577.7

   Характерным признаком апоптоза, как известно, является межнуклеосомная фрагментация ДНК хроматина [1, 2]. Апоптоз необходим для поддержания гомеостаза организма. Гены, как индуцирующие, так и подавляющие апоптоз, интенсивно изучаются [3, 4]. В последнее время особое внимание уделяется апоптозу при старении [5].
   В настоящей работе рассматривается апоптоз в лейкоцитах больных шизофренией, а также в мозге и тимоцитах крыс при старении. Обнаружен феномен непрерывной деградации ДНК хроматина в лейкоцитах больных шизофренией и в мозге и тимоцитах крыс при старении.
   ДНК хроматина клеток тимоцитов фрагментируется по межнуклеосомным участкам; у старых животных апоптоз проявляется только при их in vitro инкубации. Предполагается, что степень сплошной деградированности ДНК хроматина отражает данное физиологическое состояние организма и предшествует процессу апоптоза.
   В работе использовали 3-4-недельных (молодые) и 18-21-месячных (старые) крыс. Обработку и инкубацию тимоцитов проводили, как описано ранее [6]. Мозг (в основном из коры больших полушарий) гомогенизировали в 0.32 м сахарозе, 20 мм трис HCl pH 7.5, 3 мм MgCl₂, 100 m м ZnSO₄, 0.2 мм EGTA, 1 мм PMSF (фенилметансульфонилфлуорид), в гомогенизаторе Даунс. Центрифугировали 890xg 10мин при 4^oC. Из осадка неочищенных ядер выделяли ДНК, как описано ранее [6]. Фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 1.5%-ной агарозе в системе трис. борат pH 8.0 [7].
   Человеческие лейкоциты получали обработкой крови в четырех объемах раствора 0.75%-ного хлористого аммония, 10 мм Na-ЭДТА. Инкубировали 20 мин при 37^oC и центрифугировали со скоростью 2000 об/мин на центрифуге К-23 10 мин. Осадок лейкоцитов промывали еще 2 раза в растворе хлористого аммония, Na-ЭДТА с последующей инкубацией.
   Орган-специфическая непрерывная деградация ДНК хроматина при старении. ДНК, выделенная из ядер мозга старых крыс, значительно более деградирована (рис. 1, ряды 2-5, каждая проба выделена из отдельного животного) по сравнению с ДНК, выделенной у молодых крыс 3-4-недельного возраста (рис.1, ряд 1).

_________________________
1 А.Р. Джербашьян, автор корреспонденций

   ДНК, выделенная из тимоцитов старых крыс, более деградирована (рис. 2, ряды 2, 3), чем ДНК, выделенная из тимоцитов молодых животных (рис.2, ряд 1), в области молекулярных весов от 20 тыс. пар нуклеотидов (п.н.) до 0.2 тыс. п.н.
   Эффект деградации ДНК при старении орган - специфичен, значительно сильнее наблюдается в мозге, чем в тимоцитах (рис.1, 2).
   Индуцирование апоптоза тимоцитов крыс при инкубации клеток in vitro в процессе старения. При инкубации клеток тимуса старых крыс в среде RPMI 1640 ДНК фрагментируется по межнуклеосомным участкам хроматина (рис.2, ряд 5). Инкубация клеток тимуса молодых крыс в среде RPMI 1640 вызывает очень слабый апоптоз, межнуклеосомную фрагментацию ДНК хроматина [6]. Апоптоз наблюдается при инкубации клеток с дексаметазонацетатом (рис. 2, ряд 4).
   Непрерывная деградация ДНК хроматина лейкоцитов у больных шизофренией. В данном эксперименте выделяли ДНК из лейкоцитов донорской крови и крови больных шизофренией (12 человек), возраст которых не превышал 42 года. Больные принимали нейролептики и транквилизаторы. ДНК лейкоцитов больных шизофренией (рис.3, ряды 2-4, каждая проба выделена у отдельного пациента) отличается от ДНК из донорской крови заметной деградацией в области молекулярных весов от 20 до 0.2 тыс. п.н. Согласно литературным данным, содержание белков Bcl-2 уменьшается при шизофрении [8].
   Наши исследования показали также, что ДНК лейкоцитов больных инфарктом деградирована сильнее, чем у больных шизофренией. Феномен деградации ДНК тканеспецифичен - при старении этот процесс в мозге выражен сильнее (рис.1), чем в тимусе (рис.2, ряды 2,3).
   Интенсивность деградации ДНК выше в лейкоцитах при инфаркте миокарда, чем в лейкоцитах у больных шизофренией, т.е. деградация ДНК проявляется по-разному в разных патологиях и, следовательно, зависит от вида патологии.
   Деградация ДНК проявляется in vivo, тогда как межнуклеосомная деградация ДНК, апоптоз, обнаруживается только при инкубации клеток in vitro.
   Известно, что апоптоз при старении в разных органах и видах протекает по разному [5]. Причем в индукцию апоптоза при старении могут вовлекаться разные гены. Так, в клетках миоцитов крыс при старении не меняется содержание белков Р53, Вах и Bcl-2 [9], тогда как у Т-лимфоцитов человека при старении уменьшается содержание белков Bcl-2 [10].
   Механизмы апоптоза при старении и болезни Паркинсона различны [11]. Апоптоз усиливается при нейродегенеративных болезнях Паркинсона и Альцгеймера [4].
   Так как деградация ДНК орган-специфична и зависит от вида патологии, можно предположить, что феномен деградации ДНК и нуклеотидные последовательности деградированных фрагментов ДНК специфичны и отражают данное физиологическое состояние организма, предшествуя процессу апоптоза.
   Изучение вышеуказанных деградированных фрагментов ДНК, определение и идентификация нуклеотидных последовательностей, регуляции экспрессии могут служить ключевым подходом в познании молекулярно-биологических процессов патологий (особенно неинфекционных заболеваний), а также старения мозга и психики на уровне ДНК. Предполагается, что эти фрагменты могут быть использованы в качестве зондов для диагностики, включая раннюю.
   Используя феномен деградации ДНК, можно изучать молекулярно-биологические механизмы патологий, старения мозга и психики на уровне ДНК как причину данного состояния.
   Психонейромолекулярно-биологические исследования могут также дать возможность изучить связь между молекулярной биологией мозга и психикой человека на уровне ДНК.
   Благодарности: данная работа была финансирована Д.А.Р. (Джербашьян А.Р.), Министерством образования и науки Республики Армения; гранты: 94-30, 00-253. Авторы благодарят С.Н. Симонян и Н.С. Аветисян за участие в некоторых экспериментах.

    Институт тонкой органической химии НАН РА
    Психиатрическая больница Нубарашена

     1. Захарян Р.А., Погосян Р.Г.  - ДАН Арм ССР. 1978. Т. 67. N2. С. 110-114.
     2. Willie A.N.  - Nature. 1980. V.284. P.555-556.
     3. Steller H.  - Science. 1995. V. 267. P.1456-1462.
     4. Коршунов О.А., Преображенская И.О.  - Неврологический журнал. 1998. N1. С. 40-46.
     5. Warner H.R.  - Curr.Top. Cell Regul. 1997. V. 35. P.107-121.
     6. Джербашьян А.Р., Захарян Р.А., Казарян П.А., Симонян С.Н., Карагезян К.Г.  - ДНАН Армении. 2000. Т. 100. N1. С. 60-63.
     7. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж.  - Методы генетической инженерии. М. 1984. 477 с.
     8. Jarskog L.F., Gilmore J.H., Selinga E.S., Lieberman J.A.  - Biol. Psyshiatry. 2002. V. 48. P.641-650.
     9. Nitahara J.A., Cheng W., Liu Y, Li B., Leri A., Li P., Mogul D., Gambert S.R., Kajstura J., Anversa P.  - J.Mol. Cell. Cardiol. 1998. V. 30. P. 519-535.
     10. Aggarwal S., Gupta S.  - J. Immunol. 1998. V. 160. P. 1627-1637.
     11. Anglade P., Vyas S., Hirsch E.C., Agid Y.  - Histol. Histopothol. 1997. V. 12. P. 603-610.