УДК 577.12

   Возможная взаимосвязь между структурой мембран и физиологией клетки является одной из важнейших проблем молекулярной биологии. Известно, что для нормального метаболического статуса бактериальных клеток необходим сравнительно устойчивый уровень цитоплазматического pH, в основном регулирующийся с помощью H⁺-связанных транспортных систем [1-3]. Известно также, что переход культуры из логарифмической фазы роста в стационарную в бактериальных суспензиях определяется главным образом их межклеточными взаимодействиями [4-6] и для достижения стационарной фазы роста бактерий играют роль также изменение кислотности среды культивирования и ее обновление метаболитами. По имеющимся данным, присутствие в клетках R-плазмиды может оказывать существенное влияние на рост, размножение и сохранение бактериальных клеток S. derby [7].
   Целью настоящей работы явилось изучение влияния кислотности среды на выживаемость клеток и структурной организации клеточных стенок штаммов S. derby в зависимости от УФ-чувствительности и отсутствия в них R-плазмиды.
   В опытах использовали условно-патогенный УФ-чувствительный штамм S. derby K89 и его УФ-резистентный бесплазмидный вариант S. derby K82. В качестве питательных сред для выращивания бактериальных культур брали минимальную среду роста бактериальных культур M-9 [8] и 2%-ный мясопептонный агар.

Таблица 1 Влияние pH среды культивирования на рост и размножение клеток S. derby   Штаммы Выживаемость, % pH среды культивирования 5.02 5.5 6.5 7 7.5 8 S. derby K89, лог. фаза 32 64.38 79 82.94 100 90 S. derby K89 100 62 61.2 59.4 55.3 40 S. derby K82, лог. фаза 44.06 73 89.27 97.74 100 70.06 S. derby K82 77 98 100 94.7 74.5 50.91

Таблица 2 Относительная скорость роста клеток S. derby в зависимости от кислотности среды   Инкубационный период, ч Относительная скорость роста, m (бесплазмидные клетки) pH среды культивирования 5.02 5.5 6.5 7 7.5 8 3.5 1.3 1.58 1.52 1.52 1.51 1.107 5 5.2 2.26 2.25 2.25 2.01 1.72 6.5 1.3 1.84 1.63 1.57 1.33 1.32 Ночная культура 28 14.21 11.42 10.8 7.03 4.29 Инкубационный период, ч Относительная скорость роста, m (плазмидные клетки) pH среды культивирования 5.02 5.5 6.5 7 7.5 8 3.5 4 6.52 5.4 4.8 4.8 4.8 5 3 1.65 1.57 1.8 1.3 1.3 6.5 1.46 1.38 1.54 1.06 1.23 1.18 Ночная культура 75 37.2 24.81 20.72 15.64 12.77

Таблица 3 Относительный рост кислотности среды ночных клеток S. derby   Первоначальный pH среды культивирования Относительная скорость роста, m S. derby K89 S. derby K82 4.9 1.19 1.04 7.1 1.17 1.03

   Штаммы S. derby  выращивали при аэробных условиях с разными pH (от 5.02 до 8.0) среды культивирования. Концентрацию клеток устанавливали в определенные моменты (2, 3.5, 5, 6.5 ч) инкубационного времени с помощью ФЭК при длине волны 540 нм (светофильтр N 6) с кюветами толщиной 10 мм. В качестве основного экспериментального метода для изучения структуры мембранных суспензий служил метод дифракции рентгеновских лучей под малыми и большими углами [9]. Выделение клеточных стенок из штаммов S. derby проводилось известным способом [10] с соответствующей обработкой [7]. Данные о влиянии pH среды на рост и размножение клеток S. derby приведены в табл. 1-3. Из табл. 1 явствует, что для клеток S. derby, как плазмидных, так и бесплазмидных, в логарифмической фазе роста оптимальный pH наблюдается при значениях от 7.0 до 7.5. Изменение pH среды культивирования обоих штаммов не влияет на время достижения стационарной фазы (табл. 2). Показано, что переход плазмидных клеток S. derby K89 из логарифмической в стационарную фазу роста завершается через 2.5-3.0 ч после инкубации, а переход бесплазмидных клеток S. derby K82 - в 1.5 раза позже. Mаксимальная скорость роста наблюдается для клеток S. derby, находящихся в инкубационной среде со сравнительно низкими значениями pH окружающей среды.
   В табл. 1 показана зависимость роста ночных клеток S. derby от первоначальных значений pH инкубационной среды. Как видно из таблицы, после перехода клеток в стационарную фазу наблюдается изменение интенсивности роста в зависимости от pH среды со сдвигом в кислую сторону (максимум роста для ночных бесплазмидных клеток наблюдается при pH 6.5, а для плазмидных клеток при pH 5.02). В табл. 2 приведены данные по определению изменений относительных скоростей роста pH среды культивирования при росте плазмидных и бесплазмидных клеток S. derby. Как явствует из данных табл. 3, при росте штаммов S. derby происходит изменение кислотности инкубационной среды, что, по всей вероятности, может являться одним из факторов контролирования процесов выживаемости бактерий.
   Учитывая, что на рентгенограммах появление рефлекса с межплоскостным расстоянием 4.3A⁰ во время рентгенографического анализа характеризует состояние углеводородных цепочек молекул фосфолипидов в мембране, мы исследовали физикохимическое состояние углеводородных цепочек фосфолипидов клеточных стенок при дифракции рентгеновских лучей под большими углами. При 4.3A⁰ рефлексы для клеток S. derby отсутствуют. Это, по всей вероятности, объясняется жидким состоянием фосфолипидов мембран обоих типов клеток S. derby. В случае мембран плазмидных клеток (pH 7) при 8 и 11A⁰ возникают два четко выраженных рефлекса, имеющих форму окружности. Для мембранных суспензий, полученных из бесплазмидных клеток, во всех исследуемых значениях pH  (pH 2-10), а также для мембран плазмидных клеток в сильно кислой и щелочной среде указанные рефлексы отсутствуют.
   Ранее нами было показанно [11, 12], что основными фосфолипидами клеточных стенок S. derby являются фосфатидилхолины (ФХ) (с длиной полярных головок 11A⁰) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ) (с длиной полярных головок 8A⁰). По всей вероятности, в случае плазмидных клеток S. derby K89 имеем дело с эквидистантным расположением полярных групп молекул ФЭ и ФХ на поверхности мембран, что может стать причиной возникновения рефлексов при 8 и 11A⁰ в рентгенограммах из суспензии мембран плазмидных клеток.
   Как явствует из проведенных экспериментов, при нейтральных значениях суспензии мембраны имеют более упорядоченное внутримембранное состояние. С другой стороны, увеличение гидрофильности молекул фосфолипида или мембран должно привести к увеличению взаимодействия мембран с водой и в конечном счете - к увеличению количества молекул воды в мембранном пространстве, вызывая увеличение межплоскостного расстояния малоугловых рефлексов.
   Действительно, как в кислой (pH 2.5), так и щелочной (pH 10.9) среде имеет место увеличение межплоскостных расстояний малоугловых рефлексов при рентгенографических исследованиях, что указывает на увеличение толщины межмембранной водной прослойки.
   Интересно сравнить результаты рентгеновских исследований с данными по изучению влияния кислотности на выживаемость плазмидных и бесплазмидных клеток S. derby.
   Как отмечалось выше, мембраны клеток S. derby находятся в наиболее упорядоченном состоянии при pH 7-7.5. Изменение кислотности среды, по-видимому, влияет на гидрофильно-гидрофобные взаимодействия молекул фосфолипидов в мембранах, способствуя изменению межклеточных взаимоотношений. С другой стороны, изменение внутримембранных состояний (табл.3) имеет решающее значение в регуляции активности мембранных протеинов, а также для метаболического статуса клетки в целом.
   Таким образом, направленность кинетики влияния pH окружающей среды как для плазмидных, так и бесплазмидных клеток S. derby одинакова. Однако отсутствие R-плазмиды воздействует на кинетические параметры роста и размножения, приводя к замедлению метаболизма бесплазмидных штаммов S. derby.
   Обнаружена корреляция между отсутствием в клетках R-плазмиды и кинетическими параметрами роста и размножения клеток УФ-чувствительных и УФ-резистентных штаммов S. derby и выявлена роль R-плазмиды в формировании структурной организации клеток S. derby. Изменение кинетических параметров роста и размножения при изменении кислотности среды, по всей вероятности, обусловлено также изменением гидрофильно-гидрофобных взаимоотношений в мембранах S. derby.

     Институт молекулярной биологии НАН РА