Индукция глюкокортикоидами межнуклеосомной фрагментации ДНК хроматина впервые была показана в [1]. В дальнейшем описанное явление получило название "запрограммированной гибели" клетки. Это феномен, являющийся наиболее характерным биохимическим тестом апоптоза [2]. Апоптоз рассматривается как необходимый процесс для поддержания гоместаза организма (3). Известны гены как индуцирующие (ced 3, ced 4), так и подавляющие (red 9) апоптоз [4].
   Показано, что двухспиральная РНК (дсРНК) обладает антивирусной, интерферониндуци-рующей, противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью [5, 6].
   В данной работе мы исследовали действие дсРНК, полинуклеотидов поли (А), поли (У) и поли (Г) на апоптоз как с целью изучения регуляции апоптоза, так и для оценки антивирусного и противоопухолевого действия вышеуказанных веществ.
   В работе использовали 3 - 4-недельные белые крысы. Клетки тимуса извлекали гомогенизацией тимуса в слабо притертом гомогенизаторе Даунса в среде RPMI 1640, 2 мМ глютамин с 10% телячьей эмбриональной сывороткой. Суспензию клеток фильтровали через 4 слоя марли и инкубировали 4 ч при 37°С.
   После инкубации клетки осаждали центрифугированием 400 х g 10 мин. Осадок клеток суспензировали в 20 мМ трис-HCl рН 7.4, 25 мм Na-ЭДТА буфере, клетки лизировали добавлением тритона Х-100 до конечной концентрации 1% с последующей инкубацией 10 мин при 0°С. Добавляли Na-додецилсульфат до конечной концентрации 0.5%. ДНК выделяли обработкой протеиназой К, депротенизацией смесью хлороформ - изоамиловым спиртом (24:1) и последующей обработкой РНК-азой.
    Фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 1.5%-ной агарозе в системе трис-борат рН 8.0 [7].

   In vitro инкубация тимоцитов без добавок вызывает слабый апоптоз. В наших экспериментах мы обнаружили слабую межнуклеосомную деградацию ДНК хроматина при инкубации тимоцитов в среде без добавок (рис. 1, ряд 1).
 
 

                                                    Рис.1.                                       Рис.2.

   Рис.1. Действие дсРНК на межнуклесомную фрагментацию ДНК хромaтина тимоцитов крыс: 1-контроль без добавок; 2-инкубация клеток с дексаметазон ацетатом 5 мкг/мл; 3-инкубация с дексаметазон ацетатом 10 мкг/мл; 4-инкубация с дексаметазон ацетатом 10^-6 м; 5-инкубация с дсРНК 100 мкг/мл; 6-инкубация с дсРНК 250 мкг/мл; 7-инкубация с дсРНК 500 мкг/мл; 8-инкубация с дсРНК 250 мкг/мл и дексаметазон ацетатом 10^-6 м.
   Рис.2. Действие полинуклеотидов на межнуклесомную фрагментацию ДНК хромaтина тимоцитов: 1-ДНК тимуса без инкубации, контроль; 2-инкубация клеток с поли (А) 50 мкг/мл; 3-инкубация с поли (А) 100 мкг/мл; 4-инкубация с поли (У) 50 мкг/мл; 5-инкубация с поли (У) 100 мкг/мл; 6-инкубация с поли (Г) 50 мкг/мл; 3-инкубация с поли (Г) 100 мкг/мл.

   дсРНК индуцирует апоптоз при in vitro действии и в концентрациях 100, 250 и 500 мкг/мл вызывает межнуклеосомную фрагментацию ДНК хроматина тимоцитов (рис. 1, ряд 5-7).
   В качестве контрольного апоптоза анализировали действие дексаметазонацетата (рис. 1, ряд 2-4). Индукция апоптоза усиливается при совместном действии дсРНК и дексаметазон ацетата (рис. 1, ряд 8).
   Полинуклеотиды поли (А), поли (У) и поли (Г) индуцируют апоптоз и в концентрациях 50 и 100 мкг/мл вызывают межнуклесомальную фрагментацию хроматина (рис. 2, ряды 2-7; ряд 1 - ДНК тимоцитов без инкубации).
   Наибольший индуцирующий эффект на апоптоз имеет действие поли (У), наименьший индуцирующий эффект имеет поли (Г).
   Ранее было показано лигандообразование дсРНК с белками мозга [8].
   Известно, что при вирусных инфекциях и раковых образованиях подавляется апоптоз [3, 9].
   Полученные результаты показали, что молекулярный механизм действия дсРНК, поли (А), поли (У) и поли (Г) опосредован через индукцию запрограммированной гибели клетки.
   Вышеуказанные вещества, а из полинуклеотидов особенно поли (У), могут быть рекомендованы к применению при вирусных заболеваниях как апоптоз - индуцирующие вспомогательные терапевтические средства.
 

   Институт молекулярной биологии НАН РА
   Республиканский гематологический центр
 
 

   1. Захарян Р.А., Погосян Р.Г.ДАН АрмССР 1978. T. 67. № 2. С. 110-113.
   2. Willie A.N. - Nature. 1980. V. 284. P. 555-556.
   3. Thompson C.B. - Science. 1995. V. 267. P. 1456-1462.
   4. Steller H. - Sciense - 1995.V. 267. P. 1445-1449.
   5. Фелдмане Г.Я., Умбрашко Ю.Б., Буйкис А.Х. и др. - Вопр. вирусологии.1984. Т. 4. С. 463-468.
   6. Фомина А.Н., Григорян С.С., Зайцева О.В. и др. - Антибиотики.1980.Т. 1. С. 28-32.
   7. Хансон К.П. - Изв. АН РФ. Сер. биол.1998. Т. 2. С. 134-141.
   8. Маниатис Т., Фриг Э., Сембрук Дж. Методы генетической инженерии. М.,1984.
   9. Zakharyan R.A. - QLT/congress, ENA/FBBS-BRA. Cambridge. 1991.